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高手请进--金黄色葡萄球菌的electroporation问题
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各位虫友们， 目前这个问题已经困惑我了将近半年的时间，真心的恳请虫友们帮帮我。 为了做一个临床株的mutant strain， 我需要将一个重组的plasmid通过electroporation导入到这个金黄色葡萄球菌中。已经几乎确定过了所有步骤没有弄错--先酶切质粒和target DNA--进行ligation之后--tansformation到E.coli(DH5a)--electroporation到RN4220--细菌正常长出--再提质粒--electroporation到这个临床株的competent cells-------------什么也没长出来（大概做了几十次，从检查competent cells到重组plasmid测序及PCR确认等等）！！！ 真心着急，pasmid进不去，就做不了mutant strain，实验就不能继续往下进行。希望虫友们能给出一些指点，建议，和一些相关资料能供我学习。在此，先谢过了！！   |
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2楼2013-09-10 16:44:25
3楼2013-09-10 16:46:07
4楼2013-09-13 14:21:20
5楼2013-09-13 14:23:45
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
myprayer: 金币+5, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-10 09:57:53
yuliansheng: 金币+5, ★有帮助, 我知道你说的这些方法，我也是先电转质粒到RN4220，然后再提质粒，电转到我所研究的临床aureus株。试了好多好多次，包括电转条件，加入质粒的量等等，都没能成功导入质粒。你说的那篇文章我也读过，也试过里面所说的方法，也没能成功。（你所说的那篇文章是Transforming the Untransformable: Application of Direct Transformation To Manipulate Genetically Staphylococcus aureusand Staphylococcus epidermidis） 不过还是很感谢你。还有其他的方法或关于这方便的信息吗？ 2013-10-28 19:33:49
myprayer: 金币+5, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-10 09:57:53
yuliansheng: 金币+5, ★有帮助, 我知道你说的这些方法，我也是先电转质粒到RN4220，然后再提质粒，电转到我所研究的临床aureus株。试了好多好多次，包括电转条件，加入质粒的量等等，都没能成功导入质粒。你说的那篇文章我也读过，也试过里面所说的方法，也没能成功。（你所说的那篇文章是Transforming the Untransformable: Application of Direct Transformation To Manipulate Genetically Staphylococcus aureusand Staphylococcus epidermidis） 不过还是很感谢你。还有其他的方法或关于这方便的信息吗？ 2013-10-28 19:33:49
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你直接用质粒 电转 RN4220 时，可以加大质粒用量，可以加到5ug，提高电转效率。 另外，也不可以试试不借助RN4220，我不知道，你最终要把质粒放在哪个菌株。 在你做转化时，转入了DH5a, 这一步，可以用 E.coli DC10B，这是个为转化S.aureus设计的菌株，E.coli DH10B的突变体。 我是直接转进 DC10B, 然后提取质粒 鉴定， 电转 S.aureus Newman，中间不经过RN4220，还挺容易的。 你可以找下 E.coli DC10B的文献 |
6楼2013-10-10 06:09:18
tanxiaojuan
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