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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白相互作用，钓取受体
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seasonin

银虫 (小有名气)

[求助] 蛋白相互作用，钓取受体

我想用带his-tag的蛋白钓出细胞膜上的相应受体，也就是研究蛋白之间的相互作用，准备用his-pulldown，目前有纯化的蛋白，已经透析至水中，还有提好的细胞膜，细胞膜提取是用的生工的试剂盒，里面有DTT和蛋白酶抑制剂。

目前我有预装的纯化柱，我准备把纯化好的蛋白重新上NI柱，或者把柱子里的填料取出来（以便后面与膜蛋白孵育），我想应该是用buffer把填料处理，然后用纯化的蛋白与填料孵育，buffer洗几遍后离心收集珠子，然后在用细胞膜与柱子孵育，再用含有500mM咪唑的buffer洗几遍后离心收集珠子，最后用SDS-PAGE的上样buffer与珠子混合，煮沸离心取上清点样吧
目前有几个疑惑，希望能够得到指点
1.都说pulldown的假阳性高，那我该怎么设置对照呢？
2.关于处理填料的buffer有没有什么参考呢？
3.能不能提供一些实验中需要注意的细节呢？

再次表示感谢
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1楼 2013-09-09 19:44:40
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seasonin: 金币+1, ★有帮助 2013-09-09 21:57:40
seasonin: 金币+2, ★有帮助 2013-09-09 21:58:00
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-09-13 05:37:51
我也是做蛋白相互作用的，但pulldown的部分由实验室其他人负责，所以没法给你很详细建议。研究蛋白相互作用，任何单一方法都存在一定缺陷，最好由多种方法相互验证，譬如我们组一对蛋白相互作用分别要通过酵母mbsus，pulldown以及BiFC三种方法验证。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-09-09 21:42:57
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seasonin

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-09-09 21:42:57
我也是做蛋白相互作用的，但pulldown的部分由实验室其他人负责，所以没法给你很详细建议。研究蛋白相互作用，任何单一方法都存在一定缺陷，最好由多种方法相互验证，譬如我们组一对蛋白相互作用分别要通过酵母mbsus ...

应该是要用多种方法来验证的，我们实验室一般也只做western，co-IP什么的。
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3楼2013-09-09 21:59:24
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daniuda

铜虫 (初入文坛)
我也是做这方面的，毫无头绪
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4楼2013-11-21 21:41:13
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forensic110

新虫 (初入文坛)
我用的是磁珠，用的还行。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-11-21 23:05:01
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seasonin

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by forensic110 at 2013-11-21 23:05:01
我用的是磁珠，用的还行。

能详细说说你的protocol吗？或者是提膜蛋白的注意事项呢
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6楼2013-11-22 09:25:36
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
pulldown的假阳性你可以过一个没有histag的蛋白（相同的蛋白，只是没有histag），过出来的带和有histag过出来的带相比，就能知道那些是非特意结合的蛋白了。
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7楼2013-11-22 13:23:33
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seasonin

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-22 13:23:33
pulldown的假阳性你可以过一个没有histag的蛋白（相同的蛋白，只是没有histag），过出来的带和有histag过出来的带相比，就能知道那些是非特意结合的蛋白了。

我觉得不一定需要这么做。因为我们构建的表达载体都是携带了亲和标签的，而且我上次点样后发现，SDS-PAGE图上（膜蛋白+纯化蛋白+珠子)与（膜蛋白+珠子）没什么差别，你认为该怎么办呢？
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8楼2013-11-25 13:55:56
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