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seasonin银虫 (小有名气)
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[求助]
蛋白相互作用，钓取受体
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我想用带his-tag的蛋白钓出细胞膜上的相应受体，也就是研究蛋白之间的相互作用，准备用his-pulldown，目前有纯化的蛋白，已经透析至水中，还有提好的细胞膜，细胞膜提取是用的生工的试剂盒，里面有DTT和蛋白酶抑制剂。 目前我有预装的纯化柱，我准备把纯化好的蛋白重新上NI柱，或者把柱子里的填料取出来（以便后面与膜蛋白孵育），我想应该是用buffer把填料处理，然后用纯化的蛋白与填料孵育，buffer洗几遍后离心收集珠子，然后在用细胞膜与柱子孵育，再用含有500mM咪唑的buffer洗几遍后离心收集珠子，最后用SDS-PAGE的上样buffer与珠子混合，煮沸离心取上清点样吧 目前有几个疑惑，希望能够得到指点 1.都说pulldown的假阳性高，那我该怎么设置对照呢？ 2.关于处理填料的buffer有没有什么参考呢？ 3.能不能提供一些实验中需要注意的细节呢？ 再次表示感谢 |
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