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sars37

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[求助] 求确认双内切酶体系

TAKARA的Hind III 和EcoR I  酶，目的基因在1000bp左右，连接在2736bp的T-Vector上，PCDNA在3000多bp左右，现用两个限制性内切酶对T质粒和PCDNA进行酶切，T质粒的浓度在5.5ng/ul,PCDNA的浓度在0.8ng/ul,准备的酶切体系如下：

T质粒           稀释5倍后取1ul
10*M buffer          2ul
Hind III                  1ul
EcoR I                   1ul
h2o                       15ul
total                       20ul
37°   过夜

PCDNA                  1ul
10*M buffer          2ul
Hind III                  1ul
EcoR I                   1ul
h2o                       15ul
total                       20ul
37°  过夜

求大神指导修改体系，还有几个小问题：
过夜反应是否必要？2小时酶切可以吗？
如果想要多回收DNA，加大上样量，把体系改成40ul可以吗？
据说酶切好后，纯化电泳时做的胶不能加EB，要在跑完电泳后放在EB中泡10MIN，不然会影响后面的连接，是这样吗？
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1楼 2013-08-29 16:44:50
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ninjakiss

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sars37: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-08-29 17:23:45
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-29 18:07:46
体系本身没有什么意见；每一种酶的活力均不一致，具体的还是参照说明书来看看（不过我至少还是切3小时的，不是迫不得已不会过夜，怕影响结果）；加大上样量是可以的，但是请在配制体系时注意混匀，如果觉得单独一个管中体系过大，你可以将它们多分装一些，到时候加样的时候组合起来加也可以的（一般胶回收我们习惯是50的体系点一个大孔，不是40的），还有就是点样的时候尽可能在一个孔中多加一些，而不是增加孔数，这是为了增加你的条带亮度；染胶还有扫胶、切胶的时候一定要尽快完成，防止目的片段发生改变。当然，少染一会条带可能会有些暗，其实只要是大小正确，赶快切就好了。至于你是在胶里加EB还是跑完以后再染EB，这本身没有什么分别（我都试过，没什么问题）。
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2楼2013-08-29 16:53:48
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ninjakiss at 2013-08-29 16:53:48
体系本身没有什么意见；每一种酶的活力均不一致，具体的还是参照说明书来看看（不过我至少还是切3小时的，不是迫不得已不会过夜，怕影响结果）；加大上样量是可以的，但是请在配制体系时注意混匀，如果觉得单独一个 ...

说明书上的活性确认：在50ul反应液中，37°温度下反应1小时，将1ug的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位U。一般反应体系：
EcoR I           1ul
10*buffer       2ul
DNA              ≤1ug
h2o             up to 20 ul
50ul的全部加在1.75mm的孔？有一次加40ul都会溢出来。。。50ul体系的话这样可以吗？
T质粒           稀释5倍后取2ul
10*M buffer          5ul
Hind III                  2ul
EcoR I                   2ul
h2o                       39ul
total                       50ul
37°   过夜

PCDNA                  2ul
10*M buffer          5ul
Hind III                  2ul
EcoR I                   2ul
h2o                       39ul
total                       50ul
37°  过夜
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3楼2013-08-29 17:09:33
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ninjakiss

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-29 21:19:32
引用回帖:
3楼: Originally posted by sars37 at 2013-08-29 17:09:33
说明书上的活性确认：在50ul反应液中，37°温度下反应1小时，将1ug的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位U。一般反应体系：
EcoR I           1ul
10*buffer       2ul
DNA              ≤1ug
h2o            ...

说明书说1小时，那么就可以按照1小时来操作。制胶的梳子我们这里有三种规格，你说的1.75的可能是最小的那一种，我试过用这一种加15，那么我常常酶切30，点满满两个孔。我说的50的胶槽一横排就只有13的大孔，点50无压力的。如果你那边只有小孔梳子的话，你也可以多制备一些体系，大不了多点几个孔就是了。不过还是尽可能加大每一孔的样品量，让它们变得亮一些，你好在没染够的前提下也能发现你的目的条带。
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4楼2013-08-29 17:15:27
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sars37

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引用回帖:
4楼: Originally posted by ninjakiss at 2013-08-29 17:15:27
说明书说1小时，那么就可以按照1小时来操作。制胶的梳子我们这里有三种规格，你说的1.75的可能是最小的那一种，我试过用这一种加15，那么我常常酶切30，点满满两个孔。我说的50的胶槽一横排就只有13的大孔，点50无 ...

说错了，我们最大的是1.5的，最多也就能上40，那我就都乘以2 ，点40一个孔吧
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5楼2013-08-29 17:34:48
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aamosquito

新虫 (初入文坛)
T是5.5ng/ul？T是5.5ug/ul吧。。。
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6楼2013-08-29 17:57:58
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sars37

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6楼: Originally posted by aamosquito at 2013-08-29 17:57:58
T是5.5ng/ul？T是5.5ug/ul吧。。。

恩 对的
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7楼2013-08-29 20:52:27
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小鞋匠126_

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-30 13:41:08
sars37: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-30 16:05:39
加大反应体系到40ul，把你的各个反应液同比例扩大2被就行了。你的模版量太少了，我们提出质粒500ng/ul 都要切2-3ul。酶切不是说时间越长越好，建议考虑5小时，太长容易吧载体切碎，太多切不开。
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sars37
8楼2013-08-30 10:08:31
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sars37

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送红花一朵
???????:
8?: Originally posted by СЬ??126_ at 2013-08-30 10:08:31
?????????40ul???????????????????????2??????????????????????????????????500ng/ul ?????2-3ul????в????????????????????5С??????????????????飬????в?????

你好，我昨天???的酶切，也??切了4个??时，跑电泳??????现PCDNA的带虽然很亮，但是都是碎的，这是切碎了???，因为我的T质粒是5000ng/ul这样，所以稀释了五??，这样???以???，PCDNA800ng/ul，昨天40ul体系，切2ul的PCDNA和2ul稀释???的T质粒，但是切完???T质粒的???带很淡，PCDNA???被切碎，哎，好无助，求解救
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9楼2013-08-30 16:33:57
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sars37

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引用回帖:
8楼: Originally posted by 小鞋匠126_ at 2013-08-30 10:08:31
加大反应体系到40ul，把你的各个反应液同比例扩大2被就行了。你的模版量太少了，我们提出质粒500ng/ul 都要切2-3ul。酶切不是说时间越长越好，建议考虑5小时，太长容易吧载体切碎，太多切不开。

怎么乱码了。。你好，昨天我用40ul体系酶切，因为T质粒是5000ng/ul左右，PCDNA是800ng/ul左右，所以我取稀释后的T质粒2ul和PCDNA2ul，加酶2ul进行酶切，切了大概4小时这样，跑电泳发现T质粒的条带很弱，PCDNA的条带虽然亮，但是条带都是碎的，是不是被切碎了？好无助，求解救。。
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10楼2013-08-30 16:38:14
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