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anm0316

金虫 (小有名气)

[求助] 求助啊,谁知道pGEM-T载体连接的buffer中是不是有把载体切开的内切酶啊

哪位大侠知道,pGEM-T载体连接的buffer中是不是有把载体切开的内切酶啊,只是T4连接酶能把载体和目的片段连接起来吗?这个内切酶又是什么呢?
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励应助@! 2013-07-10 23:29:08
anm0316: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-07-11 10:06:29
没有,只是在制作载体的时候,用某个内切酶把一个位点切开,3‘端都是T,而我们PCR的产物末端多有一个A,这样经过T4连接酶就形成了dA:dT配对连接,形成有两个缺刻的环状DNA,转入细胞内后会被细胞内的连接酶补上缺口,形成完整的双链DNA,然后在胞内复制。如果我们的质粒的多克隆位点上有限制性内切酶位点,切割后也可以在3’端有T的话,也可以当T载体用。
2楼2013-07-10 13:13:16
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anm0316

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by anlewo7777 at 2013-07-10 13:13:16
没有,只是在制作载体的时候,用某个内切酶把一个位点切开,3‘端都是T,而我们PCR的产物末端多有一个A,这样经过T4连接酶就形成了dA:dT配对连接,形成有两个缺刻的环状DNA,转入细胞内后会被细胞内的连接酶补上缺口 ...

买回来的载体就是切好的吗?
3楼2013-07-10 16:04:27
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

对,载体是线性的,已经切好了。
4楼2013-07-10 20:37:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
T载体不是闭合环状的,而是带缺口的,缺口处是T,所以可以与taq酶P出来的片段或者加A的片段连接。连接时也是通过T4连接酶连的。
5楼2013-07-11 07:56:47
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anm0316

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by anlewo7777 at 2013-07-10 20:37:15
对,载体是线性的,已经切好了。

明白了,非常感谢
6楼2013-07-11 10:07:02
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anm0316

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-11 07:56:47
T载体不是闭合环状的,而是带缺口的,缺口处是T,所以可以与taq酶P出来的片段或者加A的片段连接。连接时也是通过T4连接酶连的。

谢谢
7楼2013-07-11 10:07:34
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