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求确认双内切酶体系
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TAKARA的Hind III 和EcoR I 酶，目的基因在1000bp左右，连接在2736bp的T-Vector上，PCDNA在3000多bp左右，现用两个限制性内切酶对T质粒和PCDNA进行酶切，T质粒的浓度在5.5ng/ul,PCDNA的浓度在0.8ng/ul,准备的酶切体系如下： T质粒 稀释5倍后取1ul 10*M buffer 2ul Hind III 1ul EcoR I 1ul h2o 15ul total 20ul 37° 过夜 PCDNA 1ul 10*M buffer 2ul Hind III 1ul EcoR I 1ul h2o 15ul total 20ul 37° 过夜 求大神指导修改体系，还有几个小问题： 过夜反应是否必要？2小时酶切可以吗？ 如果想要多回收DNA，加大上样量，把体系改成40ul可以吗？ 据说酶切好后，纯化电泳时做的胶不能加EB，要在跑完电泳后放在EB中泡10MIN，不然会影响后面的连接，是这样吗？ |
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说明书上的活性确认：在50ul反应液中，37°温度下反应1小时，将1ug的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位U。一般反应体系： EcoR I 1ul 10*buffer 2ul DNA ≤1ug h2o up to 20 ul 50ul的全部加在1.75mm的孔？有一次加40ul都会溢出来。。。50ul体系的话这样可以吗？ T质粒 稀释5倍后取2ul 10*M buffer 5ul Hind III 2ul EcoR I 2ul h2o 39ul total 50ul 37° 过夜 PCDNA 2ul 10*M buffer 5ul Hind III 2ul EcoR I 2ul h2o 39ul total 50ul 37° 过夜 |
3楼2013-08-29 17:09:33
ninjakiss
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| 体系本身没有什么意见；每一种酶的活力均不一致，具体的还是参照说明书来看看（不过我至少还是切3小时的，不是迫不得已不会过夜，怕影响结果）；加大上样量是可以的，但是请在配制体系时注意混匀，如果觉得单独一个管中体系过大，你可以将它们多分装一些，到时候加样的时候组合起来加也可以的（一般胶回收我们习惯是50的体系点一个大孔，不是40的），还有就是点样的时候尽可能在一个孔中多加一些，而不是增加孔数，这是为了增加你的条带亮度；染胶还有扫胶、切胶的时候一定要尽快完成，防止目的片段发生改变。当然，少染一会条带可能会有些暗，其实只要是大小正确，赶快切就好了。至于你是在胶里加EB还是跑完以后再染EB，这本身没有什么分别（我都试过，没什么问题）。 |
2楼2013-08-29 16:53:48
ninjakiss
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4楼2013-08-29 17:15:27
5楼2013-08-29 17:34:48
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