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putine

金虫 (小有名气)

[交流] PCR定点诱变

最近做PCR定点诱变，做最后的拼接PCR时，总是会出现很强的一条非特异条带，主带反而模糊不清楚。如图：
1道为maker，23道，45道和67道分别为三个扩增样品。
45道和67道扩增大小是对的，23的主带太弱了。三者都带有标签蛋白，只不过23在N端，45和67在C端。除了两端扩增引物外，中间使用的扩增引物完全相同。C端的突变构建一直很顺利。N端在引入第一个突变位点的时候也会顺利，但是继续构建的时候就出现如图所示的问题，一直扩增不出来。不知道是什么问题，各位有没有什么好的解决办法。
扩增条件：预变性后接着10个无引物循环，50度退火，之后加入引物扩增30个循环，60度退火。
第一轮的PCR产物切胶纯化后稀释到10ng使用，每个反应体系加入10-15ng
PCR定点诱变
1.png
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1楼 2013-08-28 21:47:38
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蔺相小如

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
弱弱的问一句，定点PCR的引物怎么设计呢？
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2楼2013-12-02 15:35:07
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bolysu

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-05 00:54:00
本帖内容被屏蔽
3楼2013-12-03 16:00:39
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putine

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 蔺相小如 at 2013-12-02 15:35:07
弱弱的问一句，定点PCR的引物怎么设计呢？

有好多种设计方式，有的上下游引物是完全互补的，有的是大部分互补，但有5'粘端的。两种方式我都试过，没有太大区别。大方向是保证你要突变的位置位于引物中间或者靠近5‘端。引物长度可略长于常规PCR引物，我一般设计25-30个碱基，突变位置位于12-18位。
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4楼2013-12-04 23:28:01
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蔺相小如

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by putine at 2013-12-04 23:28:01
有好多种设计方式，有的上下游引物是完全互补的，有的是大部分互补，但有5'粘端的。两种方式我都试过，没有太大区别。大方向是保证你要突变的位置位于引物中间或者靠近5‘端。引物长度可略长于常规PCR引物，我一般 ...

太感谢你了，我是完全不懂，实验室也没人做过啊。还有2问题请指教一下，1都需要做拼接PCR吗？能否解释一下呢。2如果突变位点在全长基因的中间位置，突变位置也位于引物中间，上下游引物再互补，这样直接设计出来的引物能用吗？
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5楼2013-12-06 15:54:48
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