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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于T4连接酶 大家交流下
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 关于T4连接酶 大家交流下 已有8人参与

我用的是NEB公司的T4普通连接酶，我的质粒比较大有15k左右，目的片段1k，现在我要连接，我是用热击的方法好呢还是用电转好？如果用电转的话电压应该怎么设置呢？还有就是这个酶连接之后要热失活吗？以前用的不是这个公司的酶，都不用失活，可以直接转化的呀，不知这个到底需不需要？？
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1楼 2013-08-27 15:44:42
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569323315

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
9楼: Originally posted by greenygreen at 2013-08-28 20:19:02
我一直用NEB的T4呢~觉得比别家都好用。正常连接。控制好插入片段的浓度，高点好！10:1或者更高些。我都是控制在10ul 的连接体系，16度16小时，4度2小时。然后就直接将10ul 的连接产物全部转化DH5a感受态。热击法就行 ...

亲   你好   看到你的回复 对我帮助很大   我想再麻烦请教一个问题哈   亲说的 10：1 是什么意思呢   DNA与T4liganse 的比例吗？？ 谢谢
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12楼2015-11-30 09:36:41
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-27 21:59:11
我做过比这个还大的质粒, 用的也是NEB普通T4 DNA连接酶.
我用的是热击, 没有任何问题 (没有尝试过电转, 所以不知道两者效果差别). 不需要在热击前让酶失活.
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33ggdf
2楼2013-08-27 18:36:03
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:23:38
电转化不失活也能转，不过按照NEB说法转化效率会下降。
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3楼2013-08-27 21:29:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:23:46
不失活酶是可以的。电转化的条件主要与转化宿主与电转化杯的尺寸有关，如果用2mm的杯子，大肠杆菌的条件是2.5kv（12.5kv/cm），5ms
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4楼2013-08-27 22:08:09
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