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自然_法则

银虫 (初入文坛)

[交流] 克隆技术

图为克隆后结果检测。
孔一：PET28a超螺旋质粒
孔二：连接了目的片段（大约增加1000bp）后PET28a超螺旋质粒
孔三：PET28a双酶切后开链质粒，大约5360bp
孔四五六七：均为连接了目的片段后PET28a双酶切后开链质粒
孔八：10000marker，依次为10000，7500，5000,3000等
    我的连接了目的片段后的PET28a质粒样品已经用PCR检测过，结果确实扩增出来了目的片段，表面目的片段连接导入成功，可是为什么双酶切后只有一条带，而看不到大约1000的目的条带呢？？？希望大家都来看看，帮忙分析下原因，还望各位高手指教
克隆技术
13.8.27PET28a质粒以及酶切产物.jpg
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1楼 2013-08-27 12:23:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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自然_法则: 金币+5 2013-08-27 16:23:26
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 17:13:45
你的克隆浓度太低，大片段就这么暗，小片段有可能看不到。你可以增加上样量，或者试试用单酶切看是否比空载体单酶切的片段要大。
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2楼2013-08-27 12:59:08
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自然_法则

银虫 (初入文坛)
恩 好的 我试下 谢谢
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3楼2013-08-27 16:24:07
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)
good
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4楼2013-08-27 17:22:19
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weithermo

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
自然_法则: 金币+2 2013-09-02 10:16:28
除了上面同学说的外，你应该可以和载体本身做对照的PCR反应看出差别。另外用低一点浓度的琼脂糖胶跑长时间些，看看1和2 道的差别 （在量相近时应该看出电泳速度不同）。
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5楼2013-08-28 01:06:45
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咆粑

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议低电压时间跑长点，另外确保PCR个溶液没有被污染。
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6楼2013-08-29 17:51:10
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Da果冻

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
自然_法则: 金币+2 2013-09-02 10:19:39
1.你酶切的质粒浓度太低，你可以多酶切一点，并把上样量加大，尽量多都跑电泳，看看有没有
2.你可以直接拿其中一个连上的质粒去送测序，测序有的话肯定就没问题了
3.你的未酶切质粒怎么会就一条带啊，我的有三条的
4.你可以做两组单酶切，看看是不是比你的空质粒要大1000bp
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7楼2013-08-30 16:24:21
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自然_法则

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by weithermo at 2013-08-28 01:06:45
除了上面同学说的外，你应该可以和载体本身做对照的PCR反应看出差别。另外用低一点浓度的琼脂糖胶跑长时间些，看看1和2 道的差别 （在量相近时应该看出电泳速度不同）。

恩  好的  谢谢
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8楼2013-09-02 10:16:42
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自然_法则

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Da果冻 at 2013-08-30 16:24:21
1.你酶切的质粒浓度太低，你可以多酶切一点，并把上样量加大，尽量多都跑电泳，看看有没有
2.你可以直接拿其中一个连上的质粒去送测序，测序有的话肯定就没问题了
3.你的未酶切质粒怎么会就一条带啊，我的有三条的 ...

恩恩 对啊 可以送去测序  谢谢
未酶切的质粒用的试剂盒提取的，由于没有断裂所以都是超螺旋状态，就只有一条带，其实也有三条，只是上面还有两条量很少，看不到
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9楼2013-09-02 10:19:34
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