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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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自然_法则

银虫 (初入文坛)


[交流] 克隆技术

图为克隆后结果检测。
孔一:PET28a超螺旋质粒
孔二:连接了目的片段(大约增加1000bp)后PET28a超螺旋质粒
孔三:PET28a双酶切后开链质粒,大约5360bp
孔四五六七:均为连接了目的片段后PET28a双酶切后开链质粒
孔八:10000marker,依次为10000,7500,5000,3000等
    我的连接了目的片段后的PET28a质粒样品已经用PCR检测过,结果确实扩增出来了目的片段,表面目的片段连接导入成功,可是为什么双酶切后只有一条带,而看不到大约1000的目的条带呢???希望大家都来看看,帮忙分析下原因,还望各位高手指教
克隆技术
13.8.27PET28a质粒以及酶切产物.jpg
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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自然_法则: 金币+5 2013-08-27 16:23:26
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-08-27 17:13:45
你的克隆浓度太低,大片段就这么暗,小片段有可能看不到。你可以增加上样量,或者试试用单酶切看是否比空载体单酶切的片段要大。
2楼2013-08-27 12:59:08
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自然_法则

银虫 (初入文坛)


恩 好的 我试下 谢谢
3楼2013-08-27 16:24:07
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)


4楼2013-08-27 17:22:19
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weithermo

新虫 (初入文坛)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
自然_法则: 金币+2 2013-09-02 10:16:28
除了上面同学说的外,你应该可以和载体本身做对照的PCR反应看出差别。另外用低一点浓度的琼脂糖胶跑长时间些,看看1和2 道的差别 (在量相近时应该看出电泳速度不同)。
5楼2013-08-28 01:06:45
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咆粑

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
建议低电压时间跑长点,另外确保PCR个溶液没有被污染。
6楼2013-08-29 17:51:10
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Da果冻

铜虫 (初入文坛)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
自然_法则: 金币+2 2013-09-02 10:19:39
1.你酶切的质粒浓度太低,你可以多酶切一点,并把上样量加大,尽量多都跑电泳,看看有没有
2.你可以直接拿其中一个连上的质粒去送测序,测序有的话肯定就没问题了
3.你的未酶切质粒怎么会就一条带啊,我的有三条的
4.你可以做两组单酶切,看看是不是比你的空质粒要大1000bp
7楼2013-08-30 16:24:21
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自然_法则

银虫 (初入文坛)


引用回帖:
5楼: Originally posted by weithermo at 2013-08-28 01:06:45
除了上面同学说的外,你应该可以和载体本身做对照的PCR反应看出差别。另外用低一点浓度的琼脂糖胶跑长时间些,看看1和2 道的差别 (在量相近时应该看出电泳速度不同)。

恩  好的  谢谢
8楼2013-09-02 10:16:42
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自然_法则

银虫 (初入文坛)


引用回帖:
7楼: Originally posted by Da果冻 at 2013-08-30 16:24:21
1.你酶切的质粒浓度太低,你可以多酶切一点,并把上样量加大,尽量多都跑电泳,看看有没有
2.你可以直接拿其中一个连上的质粒去送测序,测序有的话肯定就没问题了
3.你的未酶切质粒怎么会就一条带啊,我的有三条的 ...

恩恩 对啊 可以送去测序  谢谢
未酶切的质粒用的试剂盒提取的,由于没有断裂所以都是超螺旋状态,就只有一条带,其实也有三条,只是上面还有两条量很少,看不到
9楼2013-09-02 10:19:34
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