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SDS-PAGE凝胶电泳跑出来的条带问题
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做的是娃哈哈乳饮料的蛋白质测定，直接从买来的乳饮料中取样跑电泳。用的是15%的分离胶和5%的浓缩胶，但是跑出来的marker只有三条带，而且颜色非常淡，样品跑出来条带拖尾，非常不理想，请问是什么原因呢？？？求指导那，跑了三四次都这样，试剂溶液都是新配的，marker也是新买的。 201307243056.jpg |
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我在美国读博士的师姐以前写的，她在小木虫论坛的ID是凌波丽，她下月初回国度假。 SDS-PAGE electrophoresis的蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散的原因和解决方法 凌波丽 2013年10月24日 蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散可能有多种原因。 1.加样量过多，会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。为了提高分辨率，应该避免加样过多，小体积样品可给出窄带.加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。 2.加样没有立即电泳会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。加热蛋白质样品变性需要沸水浴3-5分钟即可，加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳，不要久放，因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开，但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。 3.电泳凝胶浓度选择不适当引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。请根据厂商的说明书配制对应蛋白质相对分子量的适当浓度的电泳凝胶，使得蛋白质组分的以充分分离。 4.通常靠近前沿的电泳带分辨率不佳。应根据分子量与凝胶孔径的关系，灌制适当浓度的凝胶。 5.蛋白质样品被水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融。 6.电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。 7.低于10Kd的蛋白质分子在SDS-PAGE electrophoresis不可能获得好的分辨率，此时要用Tricine胶。 8.缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。 |
21楼2015-06-25 09:07:52
spaceman_jia 
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