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ALP活性检测中细胞裂解问题
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| 大家好，想请教一下做ALP 活性检测时大家一般都用的什么方法来裂解细胞的，我看文献里面有各种不同的方法，但是都没有很详细的信息，比如Freezing-Thawing,那这个冷冻和解冻的时间各是多少呢?另外就是用Triton,0.2%,0.5%的都有，但不知道哪个效果比较好，已经多长时间比较适宜呢？另外，用triton进行裂解时是否应该在冰上操作呢？另外就是因为要做ALP活性检测，想了解下Triton的量对实验会不会有影响， 因为我的细胞数量较多，用的是24孔板，所以担心100uL的Triton不能降细胞完全裂解，所以想说用200uL或是500uL的量是不是也可以，最后各取出50uL来做BCA和ALP活性的测试。还有就是关于细胞裂解后是否需要离心的问题，我现在是裂解后就直接取出上层液进行后续的实验，没有离心，也没有在取细胞液时将孔板混匀（因为担心细胞碎片会漂到上层），不知道这样可不可以的。另外还有个最重要的问题，想请问下有没有人拍过细胞裂解后的形貌照片的，因为我发现我的细胞裂解半小时后好像还是完整的细胞，不知道是不是我的细胞根本没用裂解完全，所以想知道裂解后细胞应该是个什么样子。非常感谢！ |
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妙语1989
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8楼2013-08-07 17:38:46
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2楼2013-07-26 10:04:42
送红花一朵|
你好，非常感谢哦！那就是说取出多少量来做ALP检测或是蛋白活性检测是没有影响的是吗？冻融过程是经过-70℃和37℃反复的对吗，那就是整个冻融过程就是让它完全冻住和完全溶解是吧，溶解过程需要水浴加热不呢？但是不是温度太高会影响蛋白的活性么？ 那你把细胞全部吹大下来后应该还要离心吧，你采用的离心条件是什么呢，一定要四度不？ 另外不知道你测ALP活性的时候是用的试剂盒还是自己配置的，我看p-NP标准曲线绘制这一块，有的是把p-NP的储存液用buffer稀释到一定的浓度范围，有的确是用NaOH溶液（也就是反应终止液）来稀释到一定的浓度范围，所以我都很迷惑了。 另外不知道你有没有做过ALP染色的呢，我用的是BCIP/NTB来染的，但染出来怎么是蓝色的，感觉挺奇怪。 问题有点多，麻烦你了哦！再次感谢！ |
3楼2013-07-26 16:46:33
妙语1989
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4楼2013-07-27 10:31:35