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zfyzjh

铜虫 (小有名气)

[求助] ALP活性检测中细胞裂解问题

大家好，想请教一下做ALP 活性检测时大家一般都用的什么方法来裂解细胞的，我看文献里面有各种不同的方法，但是都没有很详细的信息，比如Freezing-Thawing,那这个冷冻和解冻的时间各是多少呢?另外就是用Triton,0.2%,0.5%的都有，但不知道哪个效果比较好，已经多长时间比较适宜呢？另外，用triton进行裂解时是否应该在冰上操作呢？另外就是因为要做ALP活性检测，想了解下Triton的量对实验会不会有影响， 因为我的细胞数量较多，用的是24孔板，所以担心100uL的Triton不能降细胞完全裂解，所以想说用200uL或是500uL的量是不是也可以，最后各取出50uL来做BCA和ALP活性的测试。还有就是关于细胞裂解后是否需要离心的问题，我现在是裂解后就直接取出上层液进行后续的实验，没有离心，也没有在取细胞液时将孔板混匀（因为担心细胞碎片会漂到上层），不知道这样可不可以的。另外还有个最重要的问题，想请问下有没有人拍过细胞裂解后的形貌照片的，因为我发现我的细胞裂解半小时后好像还是完整的细胞，不知道是不是我的细胞根本没用裂解完全，所以想知道裂解后细胞应该是个什么样子。非常感谢！
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1楼2013-07-25 22:35:02
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妙语1989

金虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-26 10:14:10
我用的是96孔板做ALP，加入150uL的0.1%的Trizol-100裂解细胞，反复冻融两次。时间不定，等它完全冻住就好。取100测ALP活性，25测蛋白活性。如果是24孔板可以稍微提高浓度或者增加裂解液的量。裂解的时候我的习惯是将细胞全部吹打下来。如果还是完整的细胞估计就没裂解好了。
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zfyzjh
2楼2013-07-26 10:04:42
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zfyzjh

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by 妙语1989 at 2013-07-26 10:04:42
我用的是96孔板做ALP，加入150uL的0.1%的Trizol-100裂解细胞，反复冻融两次。时间不定，等它完全冻住就好。取100测ALP活性，25测蛋白活性。如果是24孔板可以稍微提高浓度或者增加裂解液的量。裂解的时候我的习惯是将 ...

你好，非常感谢哦！那就是说取出多少量来做ALP检测或是蛋白活性检测是没有影响的是吗？冻融过程是经过-70℃和37℃反复的对吗，那就是整个冻融过程就是让它完全冻住和完全溶解是吧，溶解过程需要水浴加热不呢？但是不是温度太高会影响蛋白的活性么？
那你把细胞全部吹大下来后应该还要离心吧，你采用的离心条件是什么呢，一定要四度不？
另外不知道你测ALP活性的时候是用的试剂盒还是自己配置的，我看p-NP标准曲线绘制这一块，有的是把p-NP的储存液用buffer稀释到一定的浓度范围，有的确是用NaOH溶液（也就是反应终止液）来稀释到一定的浓度范围，所以我都很迷惑了。
另外不知道你有没有做过ALP染色的呢，我用的是BCIP/NTB来染的，但染出来怎么是蓝色的，感觉挺奇怪。
问题有点多，麻烦你了哦！再次感谢！
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3楼2013-07-26 16:46:33
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妙语1989

金虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by zfyzjh at 2013-07-26 16:46:33
你好，非常感谢哦！那就是说取出多少量来做ALP检测或是蛋白活性检测是没有影响的是吗？冻融过程是经过-70℃和37℃反复的对吗，那就是整个冻融过程就是让它完全冻住和完全溶解是吧，溶解过程需要水浴加热不呢？但是 ...

我们用的是PNPP检测ALP活性的。用的BCA试剂盒测蛋白，上面的说明写的是用25ul测蛋白。我们用的冻融是－20度和37度反复。就是用37度水浴加热的。冻融两次后，将裂解液吸出来4度12000r转5分钟。可以适当延长时间。
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4楼2013-07-27 10:31:35
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zfyzjh

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 妙语1989 at 2013-07-27 10:31:35
我们用的是PNPP检测ALP活性的。用的BCA试剂盒测蛋白，上面的说明写的是用25ul测蛋白。我们用的冻融是－20度和37度反复。就是用37度水浴加热的。冻融两次后，将裂解液吸出来4度12000r转5分钟。可以适当延长时间。...

哦，好的，非常感谢啊！用这个方法你们最后怎么计算ALP的活性呢？我意思是怎么把BCA的结果和pNPP的结果联系起来呢？是不是有个公式来计算的呢？另外这中间你们需要得到pNP的标准曲线吗？谢谢哦！
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5楼2013-07-29 16:07:08
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妙语1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zfyzjh at 2013-07-29 16:07:08
哦，好的，非常感谢啊！用这个方法你们最后怎么计算ALP的活性呢？我意思是怎么把BCA的结果和pNPP的结果联系起来呢？是不是有个公式来计算的呢？另外这中间你们需要得到pNP的标准曲线吗？谢谢哦！...

确实有一个公式。BCA的值是蛋白量，pNPP的值是ALP活性。一般为了结果不受细胞数目的影响，ALP活性是除去了蛋白量的。pNPP确实有标准曲线。可以问一下产品供应商，或上网查一下
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6楼2013-07-30 09:40:29
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zfyzjh

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 妙语1989 at 2013-07-30 09:40:29
确实有一个公式。BCA的值是蛋白量，pNPP的值是ALP活性。一般为了结果不受细胞数目的影响，ALP活性是除去了蛋白量的。pNPP确实有标准曲线。可以问一下产品供应商，或上网查一下...

谢谢哦！是不是通过去除蛋白量得到ALP活性并不需要pNP的标准曲线呢？因为现在用的侧ALP活性的不是试剂盒，虽然目前我得到了ALP的OD值，同时也用BCA试剂盒得到了蛋白的OD值，但是现在的问题是我不知道两者要如何转换，不知道这其中是不是还需要有pNP的标准曲线。
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7楼2013-08-06 23:32:21
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妙语1989

金虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by zfyzjh at 2013-08-06 23:32:21
谢谢哦！是不是通过去除蛋白量得到ALP活性并不需要pNP的标准曲线呢？因为现在用的侧ALP活性的不是试剂盒，虽然目前我得到了ALP的OD值，同时也用BCA试剂盒得到了蛋白的OD值，但是现在的问题是我不知道两者要如何转换 ...

你可以具体看看文献里面的吧
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8楼2013-08-07 17:38:46
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jyy0207

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 妙语1989 at 2013-07-27 10:31:35
我们用的是PNPP检测ALP活性的。用的BCA试剂盒测蛋白，上面的说明写的是用25ul测蛋白。我们用的冻融是－20度和37度反复。就是用37度水浴加热的。冻融两次后，将裂解液吸出来4度12000r转5分钟。可以适当延长时间。...

这样反复冻融，37°会破坏ALP的活性吗，楼主这样做可行吗，
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9楼2014-08-22 11:36:18
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mi622400

新虫 (初入文坛)
你好，想请教一下， 您这些ALP活性检测中细胞裂解问题都解决了么。我现在在做BMSC的成骨分化，测细胞ALP活性，您最终用的是什么方法裂解细胞呀，尤其想请教一下用裂解液和反复冻融这两种方法的具体过程，理想的细胞裂解后的状态是什么样子呀？非生物专业做生物方向，举步维艰，跪求大神指导呀！！！
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10楼2016-11-22 17:37:33
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