应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于手提质粒质量的一些问题
51/1返回列表
查看: 1466  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于手提质粒质量的一些问题

LZ最近在做质粒手提，提到的质粒最后用TE缓冲液溶解，用于PCR扩增，其中出现了一个问题，就是质粒的浓度和纯度都挺好，浓度有2ug/ul，OD260/OD280=1.9多，用提取的质粒直接进行PCR效果较好，按理说这个浓度稀释个10倍或者100倍扩增效果应该也不会太差，可是只有原始浓度的能扩增出来，稀释过的都不稳定或者扩增不出来，不知道是提取步骤除了问题还是怎么回事，注：稀释用的还是TE，请教大神分析一下原因。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-25 15:41:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 轻尘紫陌 at 2013-07-26 11:27:53
关于这个浓度的问题，我当时提的时候是500ml的菌液，最后回收质粒用了6ml溶解质粒，RNase 我是最后加入那6ml的质粒中，终浓度是40ug/ul，不知道是不是这个环节有问题，质粒提出来以后是有电泳的，上样5ul，条带非常 ...

RNase加的量没错吗？我看着很多啊。如果是40ug/ul加在6ml里面需要加0.24g的酶！
一般质粒PCR时只需要加10-100pg，所以刚开始的稀释倍数是没问题的。用TE稀释也没有关系，虽然TE里面的EDTA会对PCR反应有一点抑制，但你加的模板体积通常很少，所以EDTA的终浓度在PCR体系里是非常低的。我觉得问题主要是因为稀释后的DNA不如在浓溶液里稳定，经反复冻融后质量会有下降。所以稀释后的样品最好分装一下。
赞一下 回复此楼
4楼2013-07-26 15:08:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
轻尘紫陌: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2013-07-29 08:57:49
我没有看错吧，你用浓度是2μg/μl的质粒直接PCR？如果真是这个浓度的质粒你直接拿枪头占一下跑电泳丢可以看到带的，你需要稀释至少1000倍。
我有疑问的是你的质粒提出来后是否跑电泳观察？提质粒时是否加了RNase消化RNA？我怀疑是样品中有大量RNA，干扰DNA定量，同时也会影响引物与模板结合。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-07-26 01:22:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 01:22:12
我没有看错吧，你用浓度是2μg/μl的质粒直接PCR？如果真是这个浓度的质粒你直接拿枪头占一下跑电泳丢可以看到带的，你需要稀释至少1000倍。
我有疑问的是你的质粒提出来后是否跑电泳观察？提质粒时是否加了RNase消 ...

关于这个浓度的问题，我当时提的时候是500ml的菌液，最后回收质粒用了6ml溶解质粒，RNase 我是最后加入那6ml的质粒中，终浓度是40ug/ul，不知道是不是这个环节有问题，质粒提出来以后是有电泳的，上样5ul，条带非常亮。而且在PCR的时候，最开始是稀释10000倍都可以，后面再重复的时候渐渐的就是1000倍，100倍的才能扩增出来，不知道是不是用TE稀释会影响，
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-26 11:27:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 15:08:24
RNase加的量没错吗？我看着很多啊。如果是40ug/ul加在6ml里面需要加0.24g的酶！
一般质粒PCR时只需要加10-100pg，所以刚开始的稀释倍数是没问题的。用TE稀释也没有关系，虽然TE里面的EDTA会对PCR反应有一点抑制， ...

哦 那个RNase浓度是40ug/ml的，那可能真的是稀释后的质粒不稳定，
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-29 08:57:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 354求调剂 +3 Tyoumou 2026-03-18 5/250 2026-03-18 16:41 by Tyoumou
[考研] 一志愿天大材料与化工（085600）总分338 +3 蔡大美女 2026-03-13 3/150 2026-03-18 15:53 by jhhcooi
[考研] 314求调剂 +8 无懈可击的巨人 2026-03-12 8/400 2026-03-18 14:50 by haxia
[考研] 化工学硕306求调剂 +10 42838695 2026-03-12 10/500 2026-03-18 14:42 by haxia
[考研] 298-一志愿中国农业大学-求调剂 +7 手机用户 2026-03-17 7/350 2026-03-18 14:34 by vgtyfty
[考研] 303求调剂 +4 睿08 2026-03-17 6/300 2026-03-18 11:01 by Iveryant
[考研] 生物学071000 329分求调剂 +3 我爱生物生物爱� 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:12 by macy2011
[考研] 283求调剂 +10 小楼。 2026-03-12 14/700 2026-03-16 16:08 by 13811244083
[考研] 326求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-15 3/150 2026-03-16 07:33 by Iveryant
[考研] 求老师收留调剂 +4 jiang姜66 2026-03-14 5/250 2026-03-15 20:11 by Winj1e
[考研] 机械专硕调剂 +3 笨笨兔子 2026-03-12 3/150 2026-03-15 20:02 by 栗子粥?
[考研] 304求调剂 +6 Mochaaaa 2026-03-12 7/350 2026-03-13 22:18 by 星空星月
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 求b区学校调剂 +3 周56 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:20 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 274求调剂 +3 S.H1 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:15 by JourneyLucky
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭