应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于手提质粒质量的一些问题
51/1返回列表
查看: 1644  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于手提质粒质量的一些问题

LZ最近在做质粒手提，提到的质粒最后用TE缓冲液溶解，用于PCR扩增，其中出现了一个问题，就是质粒的浓度和纯度都挺好，浓度有2ug/ul，OD260/OD280=1.9多，用提取的质粒直接进行PCR效果较好，按理说这个浓度稀释个10倍或者100倍扩增效果应该也不会太差，可是只有原始浓度的能扩增出来，稀释过的都不稳定或者扩增不出来，不知道是提取步骤除了问题还是怎么回事，注：稀释用的还是TE，请教大神分析一下原因。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-25 15:41:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
轻尘紫陌: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2013-07-29 08:57:49
我没有看错吧，你用浓度是2μg/μl的质粒直接PCR？如果真是这个浓度的质粒你直接拿枪头占一下跑电泳丢可以看到带的，你需要稀释至少1000倍。
我有疑问的是你的质粒提出来后是否跑电泳观察？提质粒时是否加了RNase消化RNA？我怀疑是样品中有大量RNA，干扰DNA定量，同时也会影响引物与模板结合。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-07-26 01:22:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 01:22:12
我没有看错吧，你用浓度是2μg/μl的质粒直接PCR？如果真是这个浓度的质粒你直接拿枪头占一下跑电泳丢可以看到带的，你需要稀释至少1000倍。
我有疑问的是你的质粒提出来后是否跑电泳观察？提质粒时是否加了RNase消 ...

关于这个浓度的问题，我当时提的时候是500ml的菌液，最后回收质粒用了6ml溶解质粒，RNase 我是最后加入那6ml的质粒中，终浓度是40ug/ul，不知道是不是这个环节有问题，质粒提出来以后是有电泳的，上样5ul，条带非常亮。而且在PCR的时候，最开始是稀释10000倍都可以，后面再重复的时候渐渐的就是1000倍，100倍的才能扩增出来，不知道是不是用TE稀释会影响，
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-26 11:27:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 轻尘紫陌 at 2013-07-26 11:27:53
关于这个浓度的问题，我当时提的时候是500ml的菌液，最后回收质粒用了6ml溶解质粒，RNase 我是最后加入那6ml的质粒中，终浓度是40ug/ul，不知道是不是这个环节有问题，质粒提出来以后是有电泳的，上样5ul，条带非常 ...

RNase加的量没错吗？我看着很多啊。如果是40ug/ul加在6ml里面需要加0.24g的酶！
一般质粒PCR时只需要加10-100pg，所以刚开始的稀释倍数是没问题的。用TE稀释也没有关系，虽然TE里面的EDTA会对PCR反应有一点抑制，但你加的模板体积通常很少，所以EDTA的终浓度在PCR体系里是非常低的。我觉得问题主要是因为稀释后的DNA不如在浓溶液里稳定，经反复冻融后质量会有下降。所以稀释后的样品最好分装一下。
赞一下 回复此楼
4楼2013-07-26 15:08:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 15:08:24
RNase加的量没错吗？我看着很多啊。如果是40ug/ul加在6ml里面需要加0.24g的酶！
一般质粒PCR时只需要加10-100pg，所以刚开始的稀释倍数是没问题的。用TE稀释也没有关系，虽然TE里面的EDTA会对PCR反应有一点抑制， ...

哦 那个RNase浓度是40ug/ml的，那可能真的是稀释后的质粒不稳定，
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-29 08:57:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 轻尘紫陌 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +29 医学老男孩 2026-08-13 61/3050 2026-08-15 20:41 by cqbnu
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +6 wangze12014 2026-08-14 7/350 2026-08-15 20:12 by gltch
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +8 majunge000 2026-08-11 10/500 2026-08-15 18:55 by Equinoxhua
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭