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轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于手提质粒质量的一些问题

LZ最近在做质粒手提，提到的质粒最后用TE缓冲液溶解，用于PCR扩增，其中出现了一个问题，就是质粒的浓度和纯度都挺好，浓度有2ug/ul，OD260/OD280=1.9多，用提取的质粒直接进行PCR效果较好，按理说这个浓度稀释个10倍或者100倍扩增效果应该也不会太差，可是只有原始浓度的能扩增出来，稀释过的都不稳定或者扩增不出来，不知道是提取步骤除了问题还是怎么回事，注：稀释用的还是TE，请教大神分析一下原因。
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1楼 2013-07-25 15:41:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
轻尘紫陌: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2013-07-29 08:57:49
我没有看错吧，你用浓度是2μg/μl的质粒直接PCR？如果真是这个浓度的质粒你直接拿枪头占一下跑电泳丢可以看到带的，你需要稀释至少1000倍。
我有疑问的是你的质粒提出来后是否跑电泳观察？提质粒时是否加了RNase消化RNA？我怀疑是样品中有大量RNA，干扰DNA定量，同时也会影响引物与模板结合。
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2楼2013-07-26 01:22:12
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轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 01:22:12
我没有看错吧，你用浓度是2μg/μl的质粒直接PCR？如果真是这个浓度的质粒你直接拿枪头占一下跑电泳丢可以看到带的，你需要稀释至少1000倍。
我有疑问的是你的质粒提出来后是否跑电泳观察？提质粒时是否加了RNase消 ...

关于这个浓度的问题，我当时提的时候是500ml的菌液，最后回收质粒用了6ml溶解质粒，RNase 我是最后加入那6ml的质粒中，终浓度是40ug/ul，不知道是不是这个环节有问题，质粒提出来以后是有电泳的，上样5ul，条带非常亮。而且在PCR的时候，最开始是稀释10000倍都可以，后面再重复的时候渐渐的就是1000倍，100倍的才能扩增出来，不知道是不是用TE稀释会影响，
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3楼2013-07-26 11:27:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 轻尘紫陌 at 2013-07-26 11:27:53
关于这个浓度的问题，我当时提的时候是500ml的菌液，最后回收质粒用了6ml溶解质粒，RNase 我是最后加入那6ml的质粒中，终浓度是40ug/ul，不知道是不是这个环节有问题，质粒提出来以后是有电泳的，上样5ul，条带非常 ...

RNase加的量没错吗？我看着很多啊。如果是40ug/ul加在6ml里面需要加0.24g的酶！
一般质粒PCR时只需要加10-100pg，所以刚开始的稀释倍数是没问题的。用TE稀释也没有关系，虽然TE里面的EDTA会对PCR反应有一点抑制，但你加的模板体积通常很少，所以EDTA的终浓度在PCR体系里是非常低的。我觉得问题主要是因为稀释后的DNA不如在浓溶液里稳定，经反复冻融后质量会有下降。所以稀释后的样品最好分装一下。
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4楼2013-07-26 15:08:24
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轻尘紫陌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 15:08:24
RNase加的量没错吗？我看着很多啊。如果是40ug/ul加在6ml里面需要加0.24g的酶！
一般质粒PCR时只需要加10-100pg，所以刚开始的稀释倍数是没问题的。用TE稀释也没有关系，虽然TE里面的EDTA会对PCR反应有一点抑制， ...

哦 那个RNase浓度是40ug/ml的，那可能真的是稀释后的质粒不稳定，
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5楼2013-07-29 08:57:33
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