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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » EMSA实验问题
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...山雨

新虫 (初入文坛)

[求助] EMSA实验问题

最近在做EMSA实验，请教一个问题：做这个实验跑非变性胶时为啥不用考虑蛋白质的等电点呢，无论是酸性蛋白还是碱性蛋白都是用pH8.3的缓冲液？

[ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:32 ]
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1楼 2013-07-24 21:49:23
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冰岛硫化叶菌

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-07-24 22:28:21
只要你蛋白不沉淀就没事吧.
我理解EMSA是看的DNA或者RNA,只要DNA或者RNA结合到蛋白上,整个复合体就会带负电荷.因为DNA或者RNA的磷酸基团带有大量负电荷,蛋白的酸性碱性比起来不算什么.而且在大部分EMSA里只能看到F ...

我有一个疑问就是，不仅是ESMA跑胶过程中的buffer是碱性，在DNA与蛋白孵育的过程中的binding buffer也是碱性的，那么在蛋白和DNA结合的这个过程中，蛋白质如果是中性的或者是酸性的，那么就是带负电，那么蛋白怎么与带负电的DNA结合呢？因为我的实验中现在遇到这个问题，蛋白等电点是7.5,EMSA试验中检测不到shift条带，且存在很明显的堵孔现象。但footfrinting实验是能检测到有明确的结合位点的。
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5楼2017-03-25 19:27:50
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-24 23:16:09
...山雨: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-07-25 17:43:35
只要你蛋白不沉淀就没事吧.
我理解EMSA是看的DNA或者RNA,只要DNA或者RNA结合到蛋白上,整个复合体就会带负电荷.因为DNA或者RNA的磷酸基团带有大量负电荷,蛋白的酸性碱性比起来不算什么.而且在大部分EMSA里只能看到Free DNA和Bound DNA的条带,所以不在乎只有蛋白的条带会跑到哪里.
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-07-24 22:28:21
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beimi

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-25 12:48:56
...山雨: 金币+7, ★★★很有帮助 2013-10-29 10:59:27
...山雨: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-10-29 10:59:52
First if you use the denature gel the protein and DNA will separate, so then all the samples are the same. so you do not know your protein bind to your DNA or not.
second, it is not need to consider protein PI, because of shit you will know the binding of your protein to the DNA of interest. If you get the shit, that means your get the results, of course you should do some negative control.

good luck!
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3楼2013-07-25 01:50:29
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...山雨

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by beimi at 2013-07-25 01:50:29
First if you use the denature gel the protein and DNA will separate, so then all the samples are the same. so you do not know your protein bind to your DNA or not.
second, it is not need to consider ...

谢谢
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4楼2013-07-25 17:47:44
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