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| 请教各位前辈关于蛋白质方面的问题，本人以后可能要做蛋白方面的研究，现阶段是关于纯化的问题，不知道除了文献以外，有没有什么讲原理和技术的书籍可以参考，经典的和最新的都可以，还有就是研究中都可以关注些什么内容。 |
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myprayer
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5 GST-融合蛋白（GST fusion protein purification）的表达与纯化 2010-08-12 18:12:53来源：易生物实验 浏览次数：1634网友评论 0 条 GST纯化系统是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂u IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20℃保存。 关键词：蛋白GST-融合蛋白GSTfusionproteinpurificationGST纯化系统 原理 GST 纯化系统是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂u IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20℃保存。u Lysis buffer （50ml）1)2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris，pH8.0 3)90ml distilled water . 操作步骤 1)挑一个克隆至2ml LB液中（Amp+ ） 2)37℃振摇至OD600值约为0.6 3)将2ml菌液加入100 ml LB中 4)37℃振摇至OD600值约为0.6 5)加入IPTG至终浓度为1mM 6)继续摇3～4h 7)离心（5000 rpm，5min，4℃） 8)用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌 9)超声破碎细胞 10)离心（12,000rpm,15min,4℃），取上清 11)用滤纸过滤 12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱 13)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱 14)样品过柱 15)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱 16)3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白 17)收集蛋白：0.5ml/管 18)取20ml样品SDS-PAGE鉴定可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂，防止蛋白的降解。 |
6楼2013-06-29 13:16:02
Raysaslan
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2楼2013-06-29 00:38:30
myprayer
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 斑斑辛苦了 2013-06-29 13:58:21
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对于新手来说，特别是之前不是从事这方面的研究的，我结合自身的经历来说一下吧 找来相关研究内容的硕士学位论文或者博士学位论文，就当是读教材一样，先来科普让自己知道大概里面有那些常用的专业术语，那些实验技术手段，那些实验技术手段所使用的试剂和耗材等等，这样当你过一段时间后，就会有个印象，再看英文文献可能就会速度快很多，看起来也不是那么吃力。 看文献：先看你们课题组之前的发表的文章当然是和你以后研究方向相关的，如果有师兄师姐的话可以缠着他们，现在不是有句话很流行吗‘？别怕，有师兄在，师兄帮帮忙 跑题了 这样你就不用茫茫大海中找文章了 这个时候你也要自己看一些比较厉害的综述类文章，什么厉害呢？就是发表的期刊比较高，被引次数也高的这种文章，能让你清楚的知道什么热点，什么冷门 看文献怎么看论坛里面随处能找到相关的文献 此时也不要忘记看相关的教材和实验操作，楼主最好到图书馆借一些相关的实验教材 比较好的有 生物化学实验原理与技术 祈元明主编 化学工业出版社 生物化学与分子生物学实验教程 北京大学医学出版社的 里面的实验很详细还有很多注意事项比如什么有毒呀，应该采取哪些防护措施呀之类的 举个例子加入你要做WB，这里面就会告诉你有毒，做的时候该注意哪些、？当然任何一本书中都会提到相关的信息，这个完全看你个人喜好了 其实资源有很多，关键是看你怎么去索取，学生物有六个网站是需要关注 生物谷 丁香园 生物秀论坛 生物114 生物帮 再就是伟大的emuch牛人多多，高手如云 期待你的精彩吧 以下是一些网上容易找到的蛋白质相关实验技术 紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。 关键词：紫外吸收法蛋白质酪氨酸色氨酸苯丙氨酸共轭双键 （一）原 理 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。 （二）试剂及器材 （1）标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液。 （2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。 （三）操作 1. 280nm的光吸收法 （1）标准曲线的绘制：取8支试管，编号后按下表加入试剂。 混匀，选用光程为1cm的石英比色杯，在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度（OD280）。以纵坐标为光密度值，横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。 （2）样品测定：取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。 2．280nm和260nm的吸收差法将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2~2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。 公式： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 OD280—0.74 OD260 [ Last edited by myprayer on 2013-6-29 at 13:35 ] |
3楼2013-06-29 13:10:47
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3 DEAE—离子交换剂纯化血清IgG 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。再根据交换吸附于固定相上的各组分解离度的差别，运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。 关键词：离子交换血清DEAE离子交换剂血清IgG （一）原理 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。再根据交换吸附于固定相上的各组分解离度的差别，运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。 离子交换层析中的固定相称为离子交换剂。它是由在不溶性高分子母体上引入不同的可解离基团所构成。常用的不溶性高分子母体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖及人工合成的树脂等。引入于母体上的活性基团主要有酸性或碱性物质。由于引入的酸性物质可解离出H+离子，能与液相中的阳离子交换，故这类离子交换剂称为阳离子交换剂；引入的碱性物质可解离出OH－离子，能与液相中的阴离子交换，故将这类离子交换剂称为阴离子交换剂。 由于引入的酸或碱的强弱不同，两类离子交换剂又分为不同的型。 酸类物质以磺酸基（－SO3H）最强，引入磺酸基的阳离子交换剂称为强酸型；引入磷酸基（－PO3H2）、亚磷酸基（－PO2H）的称中强酸型；引入羧基（－COOH）、酚羟基（－OH）的称为弱酸型。 碱类物质主要是引入胺碱。引入季胺[ ―N+（CH3）3OH― ]基的称为强碱型；引入叔胺[－N（CH3）2 ]、仲胺（－NHCH3）、伯胺（－NH2）基的称为弱碱型。 各型离子交换剂国内外都已定型生产，性能和规格均可查到，本书附录四中列举了一部分。 各型离子交换剂的使用，将由用以分离的物质特性及分离的目的而定。 分离蛋白质（包括酶）常用纤维离子交换剂。由于蛋白质（酶）的分子量很大，在交换反应后要占有离子交换剂很大的空间位置，不溶性母体空间位置小的交换剂将无法与蛋白质交换容量很低。纤维素作为不溶性母体是因为纤维素具有亲水性强，容易溶胀；溶胀后具有舒展的长链，表面积大，使大分子特质容易接触并容纳。所以，以纤维素形成的离子交换剂对蛋白质（酶）等大分子物质的交换容量大，分辨力强，可以获得较好的分离效果及较高的因收率；另外纤维构成的离子交换剂对交换的离子吸附力较弱，用比较温和条件即可洗脱下来，不影响蛋白质（酶）等生物大分子物质的活性。纤维素的这些特点使它构成的纤维素离子交换剂在生物大分子的分离和纯化中得到广泛的使用。 纤维素上可以引入不同的解离基团而形成各型离子交换剂，其中最常用的是DEAE纤维素和羧甲基纤维素。 DEAE—纤维素（diethylaminoethyl—cellulose，DEAE）是在纤维素上引入二乙基氨基乙基， 它是弱碱型阴离交换剂。吸附蛋白质的最适pH范围为7～9，pH超过9.5，DEAE基团则不解离带电荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解离基团，与蛋白质的交换量可达75～122mg/100mgDEAE。 交换吸附于离子交换剂上的物质，通常利用改变洗脱液pH或提高洗脱液中离子强度的方法洗脱下来，从而获得较纯的特质。当在离子交换剂上吸附有几个物质成分时，可用两种方法分别洗脱下来。其一是用pH或离子强度不同的几种洗脱液分别洗脱，即在第1种洗脱液洗脱下第1个成分后，换成第2种洗脱另一成分，再换第3种洗脱液脱下第3个成分，如此洗脱下所有的成分，这种方法称为分段洗脱法。其二是在洗脱的过程中逐步改变洗脱液的离子强度，从稀到浓，逐步将各种成分洗脱下来，这种方法称为梯度洗脱法。与分段洗脱法相比，梯度法使被洗脱成分的“拖尾”现象较小，分辨率高。 应用离子交换剂来纯化物质，可以是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上，然后再分别洗脱下来获得纯品，或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上，需要的成分直接流出，得到纯品。本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG，利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG，此时IgG粗物中除IgG外，其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷，可以和DEAE上的阴离子发生交换吸附于柱上。IgG因不解离带电，而不发生交换吸附，利用此特点，让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱，即可直接收集到较纯的IgG （二）试剂及器材 （1）DEAE—纤维素的活化：称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。 用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用无离子洗至pH8左右，再转型，即可再使用。 （2）0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液 （3）奈氏试剂。 （4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。 （5）1cm×50cm （6）黑、白比色磁盘。 （三）操作 1．装柱 用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE—纤维素，并更换1～2次。然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约17cm左右为止。柱床形成后，在洗脱瓶装入0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液，接在层析柱上口，打开柱下端出口，使磷酸盐缓冲溶液流过纤维素，直至流出液的pH值与磷酸盐缓冲溶液的pH值完全相同（用pH试纸不断检查）为止。 2．上样 上述平衡过程完毕后，关闭柱下口。用滴管吸去纤维素柱面上的深液（但不能低于柱下口，控制流速使样品慢慢进入纤维素内。待全部样品进入柱后，在柱床面上加一层0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液。 3．洗脱 连接洗脱瓶，打开柱下口开始洗脱。控制流速为0.5ml/min, 用试管收集洗脱液，每管10滴。从每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盘孔中，加入1滴20%磺基水杨酸检查是否产生白色沉淀。在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为纯化的IgG。因此，从洗脱开始就应收集洗脱液，直至收集液中无蛋白质出现为止（加磺酰水杨酸不呈白色沉淀），合并含有蛋白质的各管收集液中无蛋白质即为纯化的IgG溶液。 柱内DEAE—纤维素经再生转型后可再用。 4．鉴定 纯化后获得的蛋白质样品均应进行鉴定后方能证明产品的合格证。 以上实验来自生物秀相关论坛。 |
4楼2013-06-29 13:13:08
