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| 请教各位前辈关于蛋白质方面的问题，本人以后可能要做蛋白方面的研究，现阶段是关于纯化的问题，不知道除了文献以外，有没有什么讲原理和技术的书籍可以参考，经典的和最新的都可以，还有就是研究中都可以关注些什么内容。 |
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Raysaslan
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2楼2013-06-29 00:38:30
myprayer
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对于新手来说，特别是之前不是从事这方面的研究的，我结合自身的经历来说一下吧 找来相关研究内容的硕士学位论文或者博士学位论文，就当是读教材一样，先来科普让自己知道大概里面有那些常用的专业术语，那些实验技术手段，那些实验技术手段所使用的试剂和耗材等等，这样当你过一段时间后，就会有个印象，再看英文文献可能就会速度快很多，看起来也不是那么吃力。 看文献：先看你们课题组之前的发表的文章当然是和你以后研究方向相关的，如果有师兄师姐的话可以缠着他们，现在不是有句话很流行吗‘？别怕，有师兄在，师兄帮帮忙 跑题了 这样你就不用茫茫大海中找文章了 这个时候你也要自己看一些比较厉害的综述类文章，什么厉害呢？就是发表的期刊比较高，被引次数也高的这种文章，能让你清楚的知道什么热点，什么冷门 看文献怎么看论坛里面随处能找到相关的文献 此时也不要忘记看相关的教材和实验操作，楼主最好到图书馆借一些相关的实验教材 比较好的有 生物化学实验原理与技术 祈元明主编 化学工业出版社 生物化学与分子生物学实验教程 北京大学医学出版社的 里面的实验很详细还有很多注意事项比如什么有毒呀，应该采取哪些防护措施呀之类的 举个例子加入你要做WB，这里面就会告诉你有毒，做的时候该注意哪些、？当然任何一本书中都会提到相关的信息，这个完全看你个人喜好了 其实资源有很多，关键是看你怎么去索取，学生物有六个网站是需要关注 生物谷 丁香园 生物秀论坛 生物114 生物帮 再就是伟大的emuch牛人多多，高手如云 期待你的精彩吧 以下是一些网上容易找到的蛋白质相关实验技术 紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。 关键词：紫外吸收法蛋白质酪氨酸色氨酸苯丙氨酸共轭双键 （一）原 理 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。 （二）试剂及器材 （1）标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液。 （2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。 （三）操作 1. 280nm的光吸收法 （1）标准曲线的绘制：取8支试管，编号后按下表加入试剂。 混匀，选用光程为1cm的石英比色杯，在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度（OD280）。以纵坐标为光密度值，横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。 （2）样品测定：取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。 2．280nm和260nm的吸收差法将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2~2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。 公式： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 OD280—0.74 OD260 [ Last edited by myprayer on 2013-6-29 at 13:35 ] |
3楼2013-06-29 13:10:47
myprayer
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3 DEAE—离子交换剂纯化血清IgG 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。再根据交换吸附于固定相上的各组分解离度的差别，运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。 关键词：离子交换血清DEAE离子交换剂血清IgG （一）原理 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。再根据交换吸附于固定相上的各组分解离度的差别，运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。 离子交换层析中的固定相称为离子交换剂。它是由在不溶性高分子母体上引入不同的可解离基团所构成。常用的不溶性高分子母体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖及人工合成的树脂等。引入于母体上的活性基团主要有酸性或碱性物质。由于引入的酸性物质可解离出H+离子，能与液相中的阳离子交换，故这类离子交换剂称为阳离子交换剂；引入的碱性物质可解离出OH－离子，能与液相中的阴离子交换，故将这类离子交换剂称为阴离子交换剂。 由于引入的酸或碱的强弱不同，两类离子交换剂又分为不同的型。 酸类物质以磺酸基（－SO3H）最强，引入磺酸基的阳离子交换剂称为强酸型；引入磷酸基（－PO3H2）、亚磷酸基（－PO2H）的称中强酸型；引入羧基（－COOH）、酚羟基（－OH）的称为弱酸型。 碱类物质主要是引入胺碱。引入季胺[ ―N+（CH3）3OH― ]基的称为强碱型；引入叔胺[－N（CH3）2 ]、仲胺（－NHCH3）、伯胺（－NH2）基的称为弱碱型。 各型离子交换剂国内外都已定型生产，性能和规格均可查到，本书附录四中列举了一部分。 各型离子交换剂的使用，将由用以分离的物质特性及分离的目的而定。 分离蛋白质（包括酶）常用纤维离子交换剂。由于蛋白质（酶）的分子量很大，在交换反应后要占有离子交换剂很大的空间位置，不溶性母体空间位置小的交换剂将无法与蛋白质交换容量很低。纤维素作为不溶性母体是因为纤维素具有亲水性强，容易溶胀；溶胀后具有舒展的长链，表面积大，使大分子特质容易接触并容纳。所以，以纤维素形成的离子交换剂对蛋白质（酶）等大分子物质的交换容量大，分辨力强，可以获得较好的分离效果及较高的因收率；另外纤维构成的离子交换剂对交换的离子吸附力较弱，用比较温和条件即可洗脱下来，不影响蛋白质（酶）等生物大分子物质的活性。纤维素的这些特点使它构成的纤维素离子交换剂在生物大分子的分离和纯化中得到广泛的使用。 纤维素上可以引入不同的解离基团而形成各型离子交换剂，其中最常用的是DEAE纤维素和羧甲基纤维素。 DEAE—纤维素（diethylaminoethyl—cellulose，DEAE）是在纤维素上引入二乙基氨基乙基， 它是弱碱型阴离交换剂。吸附蛋白质的最适pH范围为7～9，pH超过9.5，DEAE基团则不解离带电荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解离基团，与蛋白质的交换量可达75～122mg/100mgDEAE。 交换吸附于离子交换剂上的物质，通常利用改变洗脱液pH或提高洗脱液中离子强度的方法洗脱下来，从而获得较纯的特质。当在离子交换剂上吸附有几个物质成分时，可用两种方法分别洗脱下来。其一是用pH或离子强度不同的几种洗脱液分别洗脱，即在第1种洗脱液洗脱下第1个成分后，换成第2种洗脱另一成分，再换第3种洗脱液脱下第3个成分，如此洗脱下所有的成分，这种方法称为分段洗脱法。其二是在洗脱的过程中逐步改变洗脱液的离子强度，从稀到浓，逐步将各种成分洗脱下来，这种方法称为梯度洗脱法。与分段洗脱法相比，梯度法使被洗脱成分的“拖尾”现象较小，分辨率高。 应用离子交换剂来纯化物质，可以是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上，然后再分别洗脱下来获得纯品，或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上，需要的成分直接流出，得到纯品。本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG，利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG，此时IgG粗物中除IgG外，其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷，可以和DEAE上的阴离子发生交换吸附于柱上。IgG因不解离带电，而不发生交换吸附，利用此特点，让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱，即可直接收集到较纯的IgG （二）试剂及器材 （1）DEAE—纤维素的活化：称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。 用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用无离子洗至pH8左右，再转型，即可再使用。 （2）0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液 （3）奈氏试剂。 （4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。 （5）1cm×50cm （6）黑、白比色磁盘。 （三）操作 1．装柱 用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE—纤维素，并更换1～2次。然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约17cm左右为止。柱床形成后，在洗脱瓶装入0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液，接在层析柱上口，打开柱下端出口，使磷酸盐缓冲溶液流过纤维素，直至流出液的pH值与磷酸盐缓冲溶液的pH值完全相同（用pH试纸不断检查）为止。 2．上样 上述平衡过程完毕后，关闭柱下口。用滴管吸去纤维素柱面上的深液（但不能低于柱下口，控制流速使样品慢慢进入纤维素内。待全部样品进入柱后，在柱床面上加一层0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液。 3．洗脱 连接洗脱瓶，打开柱下口开始洗脱。控制流速为0.5ml/min, 用试管收集洗脱液，每管10滴。从每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盘孔中，加入1滴20%磺基水杨酸检查是否产生白色沉淀。在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为纯化的IgG。因此，从洗脱开始就应收集洗脱液，直至收集液中无蛋白质出现为止（加磺酰水杨酸不呈白色沉淀），合并含有蛋白质的各管收集液中无蛋白质即为纯化的IgG溶液。 柱内DEAE—纤维素经再生转型后可再用。 4．鉴定 纯化后获得的蛋白质样品均应进行鉴定后方能证明产品的合格证。 以上实验来自生物秀相关论坛。 |
4楼2013-06-29 13:13:08
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4 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（附凝胶过滤法原理及基本操作） 凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。 关键词：凝胶层析脱盐凝胶层析法分离蛋白质凝胶过滤法desalthing （一）原理 凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。 （二）试剂与器材 （1）Sephadex G-25。 （2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。 （3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。 （4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。 （5）1.5cm×20cm层析柱。 （6）黑、白比色磁盘。 （三）操作 （1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。 （2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管10滴。 （3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。 （4）由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为“脱盐”后的IgG。 注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。 附：凝胶过滤法原理及基本操作 1．原理 凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。 用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。 下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。 凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。 2．操作 （1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。 凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表： 型号 溶胀时间（小时）20~25℃ 分离范围（蛋白质，Mr） G-10 3 至700 G-15 3 至1500 G-25 3 1000~1500 G-50 3 1500~3000 G-75 24 3000~7000 必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。 凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。 （2）装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。 凝胶层析中，在把小分子物质（mw<1 500），如无机或其他物质与大分子物质 （mw<20 000）分离时，层析柱的体积一般约为样品的4–10倍，高度与直径的比例为5：1至15：1之间。这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔很小的凝胶如G–25。用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25～100倍。柱长度与直径的比例为20：1～100：1。 装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶3~5cm，并覆盖一层溶液。 灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖–2 000 （Blue dextran–2 000）通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。 刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。 在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 （3）平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。 （4）上样将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的10%～25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%～5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生特异性吸附。 上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（3～5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。 （5）洗脱用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶（洗脱瓶）中并与层析柱相通连。洗脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。 洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位置等，因此静水压又称操作压。 由于静水压越大，洗脱液的流速就越快。在固定洗脱瓶与出口位置的情况下，静水压会在洗脱过程中，随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降而减少，难以维持流速的恒定。为了解决这个问题，Marriotte首次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脱液的底部，这样洗脱液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增减将不影响静水压，从而自动保持了流速的恒定，此洗脱瓶称为恒压瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱液来解决。 在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G–75以上的软胶胶体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软胶的承受能力也不相同，静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快；其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。 脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在0.5ml/min左右，随着洗脱液的流出，样品逐步被分开。用试管收集洗脱液，按顺序每管收集2ml。 （6）检测 在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水扬酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱，如此一直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从蛋白质的管中取出1滴于白色比板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去。合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密度值为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。 （7）凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。 凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。 |
5楼2013-06-29 13:14:50
myprayer
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5 GST-融合蛋白（GST fusion protein purification）的表达与纯化 2010-08-12 18:12:53来源：易生物实验 浏览次数：1634网友评论 0 条 GST纯化系统是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂u IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20℃保存。 关键词：蛋白GST-融合蛋白GSTfusionproteinpurificationGST纯化系统 原理 GST 纯化系统是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂u IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20℃保存。u Lysis buffer （50ml）1)2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris，pH8.0 3)90ml distilled water . 操作步骤 1)挑一个克隆至2ml LB液中（Amp+ ） 2)37℃振摇至OD600值约为0.6 3)将2ml菌液加入100 ml LB中 4)37℃振摇至OD600值约为0.6 5)加入IPTG至终浓度为1mM 6)继续摇3～4h 7)离心（5000 rpm，5min，4℃） 8)用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌 9)超声破碎细胞 10)离心（12,000rpm,15min,4℃），取上清 11)用滤纸过滤 12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱 13)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱 14)样品过柱 15)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱 16)3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白 17)收集蛋白：0.5ml/管 18)取20ml样品SDS-PAGE鉴定可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂，防止蛋白的降解。 |
6楼2013-06-29 13:16:02
7楼2013-07-01 13:57:28
