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关于RT-qPCR检测病毒核酸方法的几个长时间疑惑 已有1人参与
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众所周知，采用RT-qPCR方法对病毒核酸进行定性检测是很常用的方法，但有几个具体且关键的问题我一直很疑惑，查了很多资料也没找到明确答案，请各位高手帮忙解惑~ 1、阳性标准到底该如何界定？ 对结果进行阴性阳性的判定是本方法的最终目的，我查了很多相关的中英文文献及专利，标准不一，有的认为CT值小于40定为阳性，有的小于35，有的是37，也有的一个范围，如CT值小于35为明确阳性，介于35至37之间为可疑阳性，需重复，也有的采用计算出来的模板拷贝数作为界线。对于这些标准到底该如何选择，或者说是怎么建立的？有具体的方法策略吗？ 2、关于阈值的问题 即使是确定了CT值标准，那阈值线又是如何划定的呢？很多书上的标准说法是3-15个循环的荧光值标准差的10倍，或者说可以手动调整，原则就是高于阴性对照曲线的最高点，刚进入指数期的位置。但这个具体到底该怎么操作呢？如何这么精确的定在标准差的10倍的位置啊，再说到底是算的哪些样品的曲线前3-15个循环的荧光值啊，是所有样品还是阴性对照样品还是其他？手动设定方法更不靠谱了，都是肉眼看的非常主观的调整方法，设得高一点低一点就会影响到样品的CT值，这样得到的阴性或阳性结果不是很不确定了吗？另外，每批实验阈值是否要设定完全一样？ 3、灵敏度和线性范围 MIQE指南里明确提到灵敏度和线性范围是两个不同的概念，这个我理解，一个是检测下限，一个是标曲中能保持线性的标准品拷贝数区间。但是，这两个值的确定具体该怎么操作呢？ 4、内参阳性结果的评价 通常为了评估样品本身的质量，会同时进行内参的扩增，只有内参阳性的阳本待测基因的结果才有意义。但是，内参的阳性标准又该如何界定呢？跟待测基因一样吗？还是要单独建立？ 希望有高手能为小弟解答一下这些长期的疑惑，关键问题最好有参考文献，不胜感激！ |
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 热心积极应助 2013-06-21 09:03:52
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 热心积极应助 2013-06-21 09:03:52
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问题1：一般阳性标准的判断需要做部分实际的临床样品，然后做ROC曲线，确定cutoff值。 问题2：手动设定阈值和你的经验有很大关系，一般来说也要根据你试验的具体情况来设定，对于定性的产品来说，考量的只有Ct值，所以很难去用确定的阈值定，毕竟每台的仪器荧光信号高低都不能一样，很难做到统一，做多了，你就大概能判断出来 问题3：如果把灵敏度理解为线性范围的检测下限我想就可以明白了，做法嘛也简单 问题4：内参是为了监控体系从提取到PCR扩增的假阴性，可以用管家基因，也可以用和你检测无关的其它片段来做，只要起到这样的作用就可以，所以一般来说一个完整的QPCR产品需要有内参，阳性对照阴性对照等等。 |
2楼2013-06-21 08:58:01
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