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crjtina

银虫 (小有名气)

[求助] 为什么突变体测Km和Ki测不出来，线性很乱，而同样测野生型的是没问题的

Sample Text突变体是一个碱基的突变，突变的氨基酸怀疑是它的活性基团
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赠人玫瑰，手有余香。
1楼 2013-06-19 15:04:03
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千年一雨

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crjtina: 金币+3, ★有帮助, 非常感谢，但如何解决呢，浓缩还是纯化才能得到好的线性，因为是想用数据证明那是它的活性中心 2013-06-20 14:30:05
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-20 22:16:14
应该是突变在活性中心，致使突变体活性有了极大地降低，相应测到的反应速度很小，线性化拟合就很差了！
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2楼2013-06-19 23:28:49
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 千年一雨 at 2013-06-19 23:28:49
应该是突变在活性中心，致使突变体活性有了极大地降低，相应测到的反应速度很小，线性化拟合就很差了！

非常感谢，那么请问如何提高呢，是浓缩还是纯化，或是别的方法能得到相应好的线性，因为就是想用数据说明那是活性中心
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赠人玫瑰，手有余香。
3楼2013-06-20 14:28:42
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千年一雨

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-20 22:16:30
crjtina: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-21 10:11:57
引用回帖:
3楼: Originally posted by crjtina at 2013-06-20 14:28:42
非常感谢，那么请问如何提高呢，是浓缩还是纯化，或是别的方法能得到相应好的线性，因为就是想用数据说明那是活性中心...

我好像看到这方面有的文献报道，直接说把活性中心位点突变了就没有活性了，这样说明这个位点确实是活性中心。不知道你的这个突变掉了还有多少活性，或者你们推测的反应机理是不是只有这一个活性中心位点。一般来说，如果突变活性中心附近的氨基酸残基，如果活性有成百上千倍的降低（注意，不是完全没有活性），这个时候要测其动力学参数，需要浓缩蛋白，测量的反应体系酶量加大，同时要调整反应体系及反应时间，这样才能得到比较合理的初始反应速度，来拟合米氏方程。
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4楼2013-06-20 16:13:57
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 千年一雨 at 2013-06-20 16:13:57
我好像看到这方面有的文献报道，直接说把活性中心位点突变了就没有活性了，这样说明这个位点确实是活性中心。不知道你的这个突变掉了还有多少活性，或者你们推测的反应机理是不是只有这一个活性中心位点。一般来说 ...

真的很谢谢您，我才做这方面的工作，本来这个酶的突变的方向文献都很少还没找到有关此类的，您能给我发一篇类似文献参考一下吗
还有，您说需要浓缩，我之前是用粗酶测的，但是野生型粗酶就很好测，那浓缩的粗酶突变体需要进一步纯化吗
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赠人玫瑰，手有余香。
5楼2013-06-21 10:11:07
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千年一雨

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by crjtina at 2013-06-21 10:11:07
真的很谢谢您，我才做这方面的工作，本来这个酶的突变的方向文献都很少还没找到有关此类的，您能给我发一篇类似文献参考一下吗
还有，您说需要浓缩，我之前是用粗酶测的，但是野生型粗酶就很好测，那浓缩的粗酶突 ...

你找一些新解出来的蛋白质结构晶体的相关文章，或者一些发现酶的催化机理的文章看看。另外，测酶的动力学参数，应该是用纯酶的。
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6楼2013-06-21 21:42:46
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