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质粒的线性化与转染效率 已有2人参与
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质粒DNA经转染进入细胞后，仅有一部分被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。转入基因的表达通常可以在1－4天内可以检测到。一周后，由于大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释，因此，也就检测不到其存在了。 转染可以分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定转染少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。瞬时表达适合研究启动子等调控元件。稳定转染指的是转染的质粒DNA整合到染色体上，或者相当于附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。外源基因整合的几率很小，要获得稳定转染的细胞株，通常需要有筛选标记（比如抗性基因）共同转染，通过选择压力维持表达的稳定，不能通过的就被干掉了。质粒整合到染色体上本来就是件稀罕事儿，平均万分之一的几率，如果是线性化DNA转染，那整合的几率就高多了。不过再怎么整合也就是一个或者有限的几个拷贝，所以表达量往往不会太高。但是，“压倒一切的是'稳定'”，很多时候，转染后往往要进行稳定表达的筛选。例如，常用G418进行筛选，用以获得稳定的细胞系。 |
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huoyongting
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