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目的片段与载体连接不上，化转和电转后在红霉素的板儿上不长
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| 我的目的片段大小2600，浓度大概有22ng/ul;酶切后载体大小有2700，浓度大概有63ng/ul,10ul的连接体系为solutionI 5，目的片段4，载体1，之前也做过各种片段与载体比例的梯度，用质粒的鉴定引物P连接体系，能P出目的条带，但是做化转不长菌，也做了电转（电压1800/1200/1000/800,1mm电转杯）脉冲时间均在5ms以上，也是不长，感受态都验证过了，效率很高，电转及化转都是进入大肠，涂的板儿的抗性是红霉素180ug/ul,长的很慢，将近3天，出来的也是假阳性或是不长，之前实验室的师姐用的是100ug/ul,我用就长菌膜，找到原因是抗性失效，然后重新配抗性倒的180ug/ul,求各位大神帮忙找一下问题所在，本人怀疑是连接体系的问题，所用的酶切位点是Pst1和sal1,做了将近1个月的连接，还是没连上，我都绝望了，还有试过将目的片段连T载，发现连不上，原因不明 |
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酶切专家
金虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
water9yoyo: 金币+1, ★有帮助, 提供了一个克隆技巧 2013-06-16 11:06:42
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-16 16:00:11
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-16 16:00:11
| 如果你确定你的克隆技术本身没问题（关于克隆的具体技巧，可以参见http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html），那么可能是该基因对宿主细胞有很强的毒性，这在实验中经常能碰到。 |
2楼2013-06-14 22:23:43
3楼2013-06-16 11:05:38
