| 查看: 1154 | 回复: 2 | |||
[求助]
目的片段与载体连接不上，化转和电转后在红霉素的板儿上不长
|
| 我的目的片段大小2600，浓度大概有22ng/ul;酶切后载体大小有2700，浓度大概有63ng/ul,10ul的连接体系为solutionI 5，目的片段4，载体1，之前也做过各种片段与载体比例的梯度，用质粒的鉴定引物P连接体系，能P出目的条带，但是做化转不长菌，也做了电转（电压1800/1200/1000/800,1mm电转杯）脉冲时间均在5ms以上，也是不长，感受态都验证过了，效率很高，电转及化转都是进入大肠，涂的板儿的抗性是红霉素180ug/ul,长的很慢，将近3天，出来的也是假阳性或是不长，之前实验室的师姐用的是100ug/ul,我用就长菌膜，找到原因是抗性失效，然后重新配抗性倒的180ug/ul,求各位大神帮忙找一下问题所在，本人怀疑是连接体系的问题，所用的酶切位点是Pst1和sal1,做了将近1个月的连接，还是没连上，我都绝望了，还有试过将目的片段连T载，发现连不上，原因不明 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有196人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 急求！GFP载体转化野生型枯草芽孢杆菌以及红霉素浓度
已经有15人回复
- 目的片段和T1载体连接后转入感受态细胞涂板子总不长菌……
已经有7人回复
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌
已经有11人回复
- 【求助/交流】长片段的连接转化
已经有9人回复
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
water9yoyo: 金币+1, ★有帮助, 提供了一个克隆技巧 2013-06-16 11:06:42
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-16 16:00:11
感谢参与，应助指数 +1
water9yoyo: 金币+1, ★有帮助, 提供了一个克隆技巧 2013-06-16 11:06:42
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-16 16:00:11
| 如果你确定你的克隆技术本身没问题（关于克隆的具体技巧，可以参见http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html），那么可能是该基因对宿主细胞有很强的毒性，这在实验中经常能碰到。 |
2楼2013-06-14 22:23:43
3楼2013-06-16 11:05:38
30