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怎样能得到高纯度的蛋白？ 已有4人参与
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| 我用Ni离子亲和层析纯化融合蛋白，6个His标签在载体端，然后柱上用肠激酶4°C过夜将载体与目的多肽切开，纯化得到我的目的多肽（约4.2KDa），此多肽是存在于肠激酶缓冲液中的。在中科新生命用RP-HPLC测纯度只有50%，不知道怎么回事，怎样能得到纯度>95%的蛋白呢？ |
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3楼2013-06-09 22:50:01
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kx444555: 金币+3, 很详细，鼓励交流 2013-06-09 22:03:41
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蛋白质的亲和层析的基础是蛋白质-蛋白质相互作用或者蛋白质-其他分子相互作用，这样的相互作用的专一性很高，但是不是100%，因为蛋白质-蛋白质相互作用的表面积也就是1000-2000平方埃最多，少一些600平方埃也有，每个氨基酸残基的表面积大的200平方埃，小的80平方埃，也就是说蛋白质-蛋白质相互作用也就是彼此6-10个氨基酸的表面的分子识别而已，不可能是绝对专一。所以抗体-抗原反应还存在交叉反应哪。蛋白质-其他分子相互作用可能比蛋白质-蛋白质相互作用，因为至少有机和无机小分子的表面积一般达不到6个氨基酸残基的表面积，所以可能分子识别的精确度会相对更低。所以不要完全寄希望于亲和层析一步就能完成分离纯化，之前之后都应该使用别的蛋白质分离纯化方法。需要注意三个问题： 1.蛋白质的亲和层析应该在蛋白质的后期分离时使用，在亲和层析之前样品应该用其他方法尽量纯化，减少亲和层析的分离纯化负担。蛋白质分离纯化的前期处理可用分级离心、沉淀、超滤和透析等粗分离方法；之后的细分离方法可用离子交换树脂、分子筛层析、疏水层析等。要不轻易用电泳来分离纯化，因为不好复性，用电泳做检测比较好，然后还可以疏水层析和亲和层析，亲和层析之后可以再用分子筛层析和疏水层析。 2.蛋白质的亲和层析应该不只使用一次，不要完全寄希望于亲和层析一步就能完成分离纯化。你的亲和层析因为直接用了肠激酶切断了（组氨酸）6亲和标签，所以无法再重复亲和层析了。实际上，至少第一次用Ni-（组氨酸）6亲和层析不要用肠激酶切断（组氨酸）6亲和标签，而用咪唑分浓度梯度把目的蛋白质从Ni-柱洗下来，这样可以对洗下来的样品多洗几次，最后再用肠激酶切断（组氨酸）6亲和标签进行蛋白质分离提纯，这样纯度可以高得多。因为用肠激酶切断（组氨酸）6亲和标签进行蛋白质分离提纯是不可逆的，至此也意味着亲和层析的结束。你要是一上来就用酶切的方法，那么亲和层析只用了一次，蛋白质纯度当然高不了。 3.亲和层析不是必然的蛋白质的分离纯化工作的终点。蛋白质的亲和层析之后也可以再用其他的层析方法和样品浓缩及冻干方法；必要时甚至可用电泳（如果能够保证样品充分回收和活性恢复的话）。 |
2楼2013-06-09 22:01:01
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5楼2013-06-10 08:38:45
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