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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎样能得到高纯度的蛋白？
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yhdchina

新虫 (初入文坛)

[交流] 怎样能得到高纯度的蛋白？已有4人参与

我用Ni离子亲和层析纯化融合蛋白，6个His标签在载体端，然后柱上用肠激酶4°C过夜将载体与目的多肽切开，纯化得到我的目的多肽（约4.2KDa），此多肽是存在于肠激酶缓冲液中的。在中科新生命用RP-HPLC测纯度只有50%，不知道怎么回事，怎样能得到纯度>95%的蛋白呢？
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1楼2013-06-09 10:40:29
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 很详细，鼓励交流 2013-06-09 22:03:41
蛋白质的亲和层析的基础是蛋白质-蛋白质相互作用或者蛋白质-其他分子相互作用，这样的相互作用的专一性很高，但是不是100%，因为蛋白质-蛋白质相互作用的表面积也就是1000-2000平方埃最多，少一些600平方埃也有，每个氨基酸残基的表面积大的200平方埃，小的80平方埃，也就是说蛋白质-蛋白质相互作用也就是彼此6-10个氨基酸的表面的分子识别而已，不可能是绝对专一。所以抗体-抗原反应还存在交叉反应哪。蛋白质-其他分子相互作用可能比蛋白质-蛋白质相互作用，因为至少有机和无机小分子的表面积一般达不到6个氨基酸残基的表面积，所以可能分子识别的精确度会相对更低。所以不要完全寄希望于亲和层析一步就能完成分离纯化，之前之后都应该使用别的蛋白质分离纯化方法。需要注意三个问题：
1.蛋白质的亲和层析应该在蛋白质的后期分离时使用，在亲和层析之前样品应该用其他方法尽量纯化，减少亲和层析的分离纯化负担。蛋白质分离纯化的前期处理可用分级离心、沉淀、超滤和透析等粗分离方法；之后的细分离方法可用离子交换树脂、分子筛层析、疏水层析等。要不轻易用电泳来分离纯化，因为不好复性，用电泳做检测比较好，然后还可以疏水层析和亲和层析，亲和层析之后可以再用分子筛层析和疏水层析。
2.蛋白质的亲和层析应该不只使用一次，不要完全寄希望于亲和层析一步就能完成分离纯化。你的亲和层析因为直接用了肠激酶切断了（组氨酸）6亲和标签，所以无法再重复亲和层析了。实际上，至少第一次用Ni-（组氨酸）6亲和层析不要用肠激酶切断（组氨酸）6亲和标签，而用咪唑分浓度梯度把目的蛋白质从Ni-柱洗下来，这样可以对洗下来的样品多洗几次，最后再用肠激酶切断（组氨酸）6亲和标签进行蛋白质分离提纯，这样纯度可以高得多。因为用肠激酶切断（组氨酸）6亲和标签进行蛋白质分离提纯是不可逆的，至此也意味着亲和层析的结束。你要是一上来就用酶切的方法，那么亲和层析只用了一次，蛋白质纯度当然高不了。
3.亲和层析不是必然的蛋白质的分离纯化工作的终点。蛋白质的亲和层析之后也可以再用其他的层析方法和样品浓缩及冻干方法；必要时甚至可用电泳（如果能够保证样品充分回收和活性恢复的话）。
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2楼2013-06-09 22:01:01
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fuding6

木虫 (小有名气)
★
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要做到95%以上很容易，用C18反相住纯化便可得到。
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3楼2013-06-09 22:50:01
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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3楼: Originally posted by fuding6 at 2013-06-09 22:50:01
要做到95%以上很容易，用C18反相住纯化便可得到。

要是真么简单就能分离分离蛋白质的话，你就该获得诺贝尔科学奖！
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4楼2013-06-10 01:36:02
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-10 16:57:56
真是把纯化想的太简单了！
要是一步Ni柱亲和就能达到90%以上的纯度，纯化就不是一个难事了！
最好还是先从Ni洗脱出来，然后通过离子柱，凝胶柱等进一步纯化之后，反过来再上Ni住，进行你那个实验！没准有戏！
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5楼2013-06-10 08:38:45
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fuding6

木虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-10 01:36:02
要是真么简单就能分离分离蛋白质的话，你就该获得诺贝尔科学奖！...

那是因为你没做过多肽的纯化，多肽的纯化都是用反相制备的，吉尔生化就做这个。
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6楼2013-06-10 10:30:50
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yhdchina

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-09 22:01:01
蛋白质的亲和层析的基础是蛋白质-蛋白质相互作用或者蛋白质-其他分子相互作用，这样的相互作用的专一性很高，但是不是100%，因为蛋白质-蛋白质相互作用的表面积也就是1000-2000平方埃最多，少一些600平方埃也有，每 ...

我的标签在PET表达的载体上，肠激酶切开的是带标签的PET载体蛋白和我的目的多肽。我以前也是先让融合蛋白与树脂结合——梯度咪唑洗脱——透析——肠激酶酶切——将存在于肠激酶中的切开的蛋白溶液再与树脂吸附——带标签的PET载体蛋白吸到树脂上，目的多肽下来。但这样的问题是切完后再去洗，标签与树脂的结合降低了，纯化效率特别低。后来，我就采取融合蛋白吸附到树脂上后直接用肠激酶把我的目的多肽切下来。
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7楼2013-06-10 11:07:05
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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6楼: Originally posted by fuding6 at 2013-06-10 10:30:50
那是因为你没做过多肽的纯化，多肽的纯化都是用反相制备的，吉尔生化就做这个。...

究竟谁没有做蛋白质纯化呀！多肽的纯化都是用反相制备？？你胡说什么那？？就算是的话，多肽和蛋白质是一回事吗？！
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8楼2013-06-10 11:56:09
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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7楼: Originally posted by yhdchina at 2013-06-10 11:07:05
我的标签在PET表达的载体上，肠激酶切开的是带标签的PET载体蛋白和我的目的多肽。我以前也是先让融合蛋白与树脂结合——梯度咪唑洗脱——透析——肠激酶酶切——将存在于肠激酶中的切开的蛋白溶液再与树脂吸附—— ...

那么你就要用其他的该蛋白质的特征，对蛋白质加以进一步纯化。
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9楼2013-06-10 11:57:35
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凌波丽

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6楼: Originally posted by fuding6 at 2013-06-10 10:30:50
那是因为你没做过多肽的纯化，多肽的纯化都是用反相制备的，吉尔生化就做这个。...

吉尔生化很有名吗！！？？你学过基本的蛋白质化学吗？？！！一种纯化蛋白中的方法居然能够放之四海而皆准！！！？？？蛋白质和多肽是一回事？？？！！！
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10楼2013-06-10 12:00:19
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