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丫头小盆子

新虫 (小有名气)

[求助] 类囊体提取，大神帮帮忙，各位路过虫友看看帮帮忙，

各位大神有没有做过提取苔藓类或者是藻类的类囊体的？救命救命啊……我查阅很多文献，发现大多都是提取高等植物如菠菜、拟南芥、大麦、水稻什么的，而且方法大概都差不多。然后我按提取拟南芥类囊体的方法提取苔藓类植物的类囊体膜和PSII颗粒，然后跑蛋白胶SDS和Western检测，发现都没有相应条带。
  我做了接近一个多月了，几乎天天做，每个步骤也都有不断调整，但是情况还是不容乐观，老板又天天问进展，想死的心都有了。各位大神帮帮忙吧，是因为我提取的protocol不适用于低等植物的提取还是什么原因呢？各位大神有没有做过这方面的嘛，帮帮忙吧，能不能分享下您们的方法呢？拜谢！！
补充下我的protocl:
A液isolation buffer      (50 mm Hepes-KOH        330 mm Sorbitol        2 mm EDTA    1 mm MgCl2    5 mm 抗坏血酸         0.05% BSA      10 mm NaF)
B液低渗溶胀缓冲液(50 mm Hepes-KOH        5 mm Sorbitol       10 mm NaF)        
C液storage buffer （50 mm Hepes-KOH   100 mm Sorbitol               10 mm MgCl2        10 mm NaF        )
步骤：
浸洗后，剪成碎片，加入３倍体积预冷的isolation buffer，用预冷的杵和研钵研成匀浆。匀浆液通过两层尼龙布过滤，２０００ｇ,4°C，离心5min。弃去上清液，沉淀用isolation buffer重悬。重悬液500g，4°C离心20s,去除沉淀。上清液2000g, 4°C，离心5min.所得沉淀即为叶绿体沉淀。叶绿体沉淀重悬于B buffer以便进行低渗溶胀后，3000g, 4°C，离心10min以分离得到类囊体膜沉淀。（沉淀存储于storage buffer中。叶绿体含量用80%丙酮法-分光光度计法测定测定。得到的类囊体膜沉淀要么立即使用，或者是在液N2冷冻后分装在-80°C后备用。
（整个过程需低温避光）
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1楼 2013-06-08 15:37:55
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pissor

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
丫头小盆子: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢，我按您的方法试试，有问题再交流 2013-06-12 11:23:21
试着不要从提叶绿体开始，而是直接提类囊体膜。
方法：用预冷的提取液(400 mM蔗糖，10 mM NaCl，50 mM Hepes-KOH，pH7.8，2 mM MgCl2)
在冰上进行研磨，两层尼龙布过滤后，5,000 g离心10 min，沉淀用提取液悬浮，洗涤，再次离心。
祝顺利！
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游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
2楼2013-06-11 22:29:34
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丫头小盆子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pissor at 2013-06-11 22:29:34
试着不要从提叶绿体开始，而是直接提类囊体膜。
方法：用预冷的提取液(400 mM蔗糖，10 mM NaCl，50 mM Hepes-KOH，pH7.8，2 mM MgCl2)
在冰上进行研磨，两层尼龙布过滤后，5,000 g离心10 min，沉淀用提取液悬浮， ...

大神能不能麻烦您补充下完整的protocol呀？你方法的后续步骤我不是很清楚。是用提取液再次离心，转速时间仍然是5000g,10min么？那沉淀用还需要用什么悬浮？还需要再离心什么的吗？大神再麻烦下您啦，谢谢谢谢！！！
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3楼2013-06-12 11:27:26
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pissor

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 丫头小盆子 at 2013-06-12 11:27:26
大神能不能麻烦您补充下完整的protocol呀？你方法的后续步骤我不是很清楚。是用提取液再次离心，转速时间仍然是5000g,10min么？那沉淀用还需要用什么悬浮？还需要再离心什么的吗？大神再麻烦下您啦，谢谢谢谢！！！...

就是用上述提取液再洗涤一次，5000g,10min后，再用提取液悬浮即可。
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游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
4楼2013-06-13 15:27:55
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paparazzii

新虫 (初入文坛)
我最近也需要提取类囊体，还在看文献，想求这个方法的参考文献？能发我一下吗？感激不尽！！！
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5楼2019-04-12 14:52:39
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2015031101

新虫 (初入文坛)
请问您最后提出类囊体膜蛋白了嘛，如果提出来，可以的话，请救救孩子吧，万分感谢
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6楼2020-08-15 10:18:07
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