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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-08 08:42:59
如ls所说，富集或WB检查蛋白质表达。蛋白质在Ecoli内表达，只有表达量的差别（差别会非常大），还没有见过完全不表达的。

如果还没有蛋白质表达，还是检查一下质粒。不明白为什么制备了质粒，还在再酶切，连到另一载体。有没有检查第二次制备的质粒。
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11楼2013-06-08 03:54:27
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:24:58
会不会你的蛋白有毒性呢，换个宿主菌试试。C43（DE3）表达疏水性蛋白就很好用
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身体健康，工作顺利
12楼2013-06-08 08:28:59
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by mitocam at 2013-06-08 03:54:27
如ls所说，富集或WB检查蛋白质表达。蛋白质在Ecoli内表达，只有表达量的差别（差别会非常大），还没有见过完全不表达的。

如果还没有蛋白质表达，还是检查一下质粒。不明白为什么制备了质粒，还在再酶切，连到另 ...

第二次的质粒倒是没有酶切鉴定过，但是菌液送出测序结果都是正确的，酶切位点也是正确的。

我想能否先将菌液大量培养，纯化出来看看呢
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13楼2013-06-08 10:27:17
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by aoda123 at 2013-06-08 08:28:59
会不会你的蛋白有毒性呢，换个宿主菌试试。C43（DE3）表达疏水性蛋白就很好用

我这是个跨膜蛋白，以前有人在DH5α里面也有表达出来过。C43（DE3）这个我们没有用过呢，可能要起来比较困难
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14楼2013-06-08 10:31:46
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2013-06-06 23:59:39
如果有很低的表达，page上是看不出来了，而WB敏感性很强的，可以检测到很低的表达，所以page看不出来，做WB还是有意义的...

我打算先大量培养，纯化出来看看，是否可行呢？
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15楼2013-06-08 10:32:26
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2013-06-07 10:37:23
其实，你不能通过SDS-PAGE就判断有没有表达，有的蛋白表达量是很少的，胶上是看不出来的。如果有标签的话，先富集下就能看得出来了。或者像楼上所说的做WB。

你的意思是先大量培养，然后纯化出来看看是吗？我正打算这样做。但是有一个问题，就是如果这个蛋白真的是表达量较少，那么我后面如果要用来免疫的话会不会浓度不够？
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16楼2013-06-08 10:33:38
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yanfang2012 at 2013-06-07 14:39:38
你的诱导温度是不是有点高，我用20~25℃...

后面可以尝试做个梯度吧
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17楼2013-06-08 10:34:05
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zx1984 at 2013-06-07 16:37:07
将IPTG和温度都设定梯度筛选，试试吧，一般都要设梯度筛选，你的条件是比较大众化的，有的不一定合适。...

这是参照以前诱导成功的诱导条件。恩恩，会参考你的意见，谢谢！
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18楼2013-06-08 10:34:48
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-08 04:31:46
我这是个跨膜蛋白，以前有人在DH5α里面也有表达出来过。C43（DE3）这个我们没有用过呢，可能要起来比较困难...

我做的也是跨膜蛋白，之前用BL21和Rosetta里面都不表达。不然你就优化你的诱导条件
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身体健康，工作顺利
19楼2013-06-08 10:49:46
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-06-07 23:14:58
低温诱导?16度过夜试试?难道是包涵体么?转速降低一点.包涵体是看不出来的,你超声破碎,分别跑上清和沉淀试试吧..

这个蛋白是以包涵体存在的。我查了一下，长时间低温诱导的作用是减少包涵体的形成。那么我的蛋白表达量是不是也会减少呢？
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20楼2013-06-08 11:05:38
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