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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by aoda123 at 2013-06-08 10:49:46
我做的也是跨膜蛋白，之前用BL21和Rosetta里面都不表达。不然你就优化你的诱导条件...

好的，会参考你的意见，我也想办法要要看这个菌株做一批感受态试试，谢谢你！
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21楼2013-06-08 11:13:24
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EthanXJY

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sherrysure(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:25:19
请看下序列中是否含有大肠杆菌稀有密码子~假如有，使用transetta菌株~
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22楼2013-06-08 11:41:04
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fuding6

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
密码子优化一下，或纯化富集一下再跑电泳。问题总会解决的。
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23楼2013-06-08 13:39:28
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-08 10:33:38
你的意思是先大量培养，然后纯化出来看看是吗？我正打算这样做。但是有一个问题，就是如果这个蛋白真的是表达量较少，那么我后面如果要用来免疫的话会不会浓度不够？...

免疫只是个检测手段，完全有可能检测不出来的。所以我建议是能富集的情况下，先富集再检测
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24楼2013-06-08 14:01:54
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
sherrysure(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:25:30
要是包涵体,你就长时间低温,然后破碎吧.不是说减少蛋白表达,是减少形成包涵体..或者你就试试28度220转,6个小时,然后拿去破碎跑沉淀和上清,做western吧..
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25楼2013-06-08 16:33:52
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-08 10:32:26
我打算先大量培养，纯化出来看看，是否可行呢？...

是可行的，但是你还要有一步就是优化纯化条件，不然有时候也是看不到纯化条带
我在昆虫细胞中表达蛋白，刚开始也是检测不到，通过纯化之后，终于看到了
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26楼2013-06-09 01:39:10
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-08 11:05:38
这个蛋白是以包涵体存在的。我查了一下，长时间低温诱导的作用是减少包涵体的形成。那么我的蛋白表达量是不是也会减少呢？...

个人认为吧，你还是先不要考虑这么多如温度影响表达量啊，以后蛋白量够不够啊之类的问题，现在先考虑的是如何能看到蛋白表达，只有蛋白表达了，才能说以后的话
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27楼2013-06-09 01:42:08
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-06-08 16:33:52
要是包涵体,你就长时间低温,然后破碎吧.不是说减少蛋白表达,是减少形成包涵体..或者你就试试28度220转,6个小时,然后拿去破碎跑沉淀和上清,做western吧..

也就是说我的蛋白还是会表达的，就是不形成包涵体了是吗？低温过夜一般是怎样的呢？16度12h？
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28楼2013-06-11 17:03:49
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2013-06-09 01:39:10
是可行的，但是你还要有一步就是优化纯化条件，不然有时候也是看不到纯化条带
我在昆虫细胞中表达蛋白，刚开始也是检测不到，通过纯化之后，终于看到了...

还想请问一下纯化条件应该如何优化呢？有哪些基本参数需要注意的地方吗？目前还没有做过纯化，但是看师兄做过，还是求指点一下细节~谢谢！！
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29楼2013-06-11 17:07:32
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主
引用回帖:
29楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-11 17:07:32
还想请问一下纯化条件应该如何优化呢？有哪些基本参数需要注意的地方吗？目前还没有做过纯化，但是看师兄做过，还是求指点一下细节~谢谢！！...

这个我就说不好了，不同的标签蛋白纯化也不一样，我做的是GST标签纯化的
你最好问一下你们做过的师兄吧
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30楼2013-06-12 02:48:05
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