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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图
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pengyun2521

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-05 08:25:47
诱导的时间也可以进行优化一下，先跨度大一点，然后可以进一步优化! 个人经验，小量表达可能看不出来，测序是对的，直接大量表达。该过程中加入诱导剂的时刻也是很重要的，一般在OD600为1.0左右，当然不同蛋白需区别对待！
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不积跬步无以至千里！
31楼2013-06-12 08:10:15
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
28楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-11 17:03:49
也就是说我的蛋白还是会表达的，就是不形成包涵体了是吗？低温过夜一般是怎样的呢？16度12h？...

如果你的序列正确，肯定会表达的啦。除非有毒性吧。一般跑不出来就是包涵体了，16度过夜试试呗，还是不行你就超声破碎，破碎以后分别取上清和沉淀煮沸来跑。沉淀有，上清没有就是包涵体，两个都有就是一部分形成包涵体。要是上清有的话，你可以试试优化条件。

如果你的蛋白对表达宿主有特殊要求你也应该换成真核的试试吧。
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32楼2013-06-13 14:59:32
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:25:56
这个我遇到过相同问题，你看到条带不大，不代表没表达，我表达过表达量很少的条带，比空白载体诱导只多了一条很细的条带，做了个原位酶谱，发现它在那个位置表达了，后来我发现是信号肽的问题，重新构建，切掉信号肽表达量大多了，位置也对了，但是相对于别人很大量的表达，还是算少的
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33楼2013-06-26 20:39:13
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

诱导温度可以28度。。诱导可以时间长些，上样量少点。。
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34楼2013-06-26 21:17:05
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
sherrysure(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-05 08:26:10
楼主换了几个载体，就没想过换宿主吗？Rosetta不行的，换Rosetta（DE3)或其他类似（DE3)宿主吧。
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为什么
35楼2013-06-26 23:31:03
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jiangtailong

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

IPTG浓度我们用的是0.1，诱导时OD不能太低，诱导时间可以长点，跑电泳可以选择破碎上清和全细胞
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36楼2013-06-27 12:31:59
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cqq309

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
sherrysure(myprayer代发): 金币+1, 鼓励发帖积极交流，分子生物期待你更多精彩 2013-07-05 08:26:27
我们实验室一个师弟做过，蛋白表达量比较低，SDS-PAGE看不出差别，但WB能检测出来。另外，应该把上清和沉淀都检测，因为你不确定蛋白会在哪里
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37楼2013-06-27 13:01:55
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zou43118217

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

超声破碎，再纯化上清检测一下BCA确定有的话可以将上清冻干浓缩一下再跑胶，或者wb
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38楼2013-06-27 20:49:04
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2013-06-06 23:59:39
如果有很低的表达，page上是看不出来了，而WB敏感性很强的，可以检测到很低的表达，所以page看不出来，做WB还是有意义的...

我想尝试做WB，但是做完蛋白纯化跑PAGE的时候居然什么条带也没有。。是不是真的没有表达？好难过。。。
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39楼2013-07-04 08:55:03
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2013-06-07 10:37:23
其实，你不能通过SDS-PAGE就判断有没有表达，有的蛋白表达量是很少的，胶上是看不出来的。如果有标签的话，先富集下就能看得出来了。或者像楼上所说的做WB。

我想尝试做WB，但是大量扩繁 做完蛋白纯化 跑PAGE的时候居然什么条带也没有。。是不是真的没有表达？好难过。。。
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40楼2013-07-04 08:56:52
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