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pengyun2521

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-05 08:25:47
诱导的时间也可以进行优化一下,先跨度大一点,然后可以进一步优化! 个人经验,小量表达可能看不出来,测序是对的,直接大量表达。该过程中加入诱导剂的时刻也是很重要的,一般在OD600为1.0左右,当然不同蛋白需区别对待!
不积跬步无以至千里!
31楼2013-06-12 08:10:15
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
28楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-11 17:03:49
也就是说我的蛋白还是会表达的,就是不形成包涵体了是吗?低温过夜一般是怎样的呢?16度12h?...

如果你的序列正确,肯定会表达的啦。除非有毒性吧。一般跑不出来就是包涵体了,16度过夜试试呗,还是不行你就超声破碎,破碎以后分别取上清和沉淀煮沸来跑。沉淀有,上清没有就是包涵体,两个都有就是一部分形成包涵体。要是上清有的话,你可以试试优化条件。

如果你的蛋白对表达宿主有特殊要求你也应该换成真核的试试吧。
32楼2013-06-13 14:59:32
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:25:56
这个我遇到过相同问题,你看到条带不大,不代表没表达,我表达过表达量很少的条带,比空白载体诱导只多了一条很细的条带,做了个原位酶谱,发现它在那个位置表达了,后来我发现是信号肽的问题,重新构建,切掉信号肽表达量大多了,位置也对了,但是相对于别人很大量的表达,还是算少的
33楼2013-06-26 20:39:13
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

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诱导温度可以28度。。诱导可以时间长些,上样量少点。。
34楼2013-06-26 21:17:05
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


sherrysure(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-05 08:26:10
楼主换了几个载体,就没想过换宿主吗?Rosetta不行的,换Rosetta(DE3)或其他类似(DE3)宿主吧。
为什么
35楼2013-06-26 23:31:03
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jiangtailong

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

IPTG浓度我们用的是0.1,诱导时OD不能太低,诱导时间可以长点,跑电泳可以选择破碎上清和全细胞
36楼2013-06-27 12:31:59
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cqq309

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


sherrysure(myprayer代发): 金币+1, 鼓励发帖积极交流,分子生物期待你更多精彩 2013-07-05 08:26:27
我们实验室一个师弟做过,蛋白表达量比较低,SDS-PAGE看不出差别,但WB能检测出来。另外,应该把上清和沉淀都检测,因为你不确定蛋白会在哪里
37楼2013-06-27 13:01:55
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zou43118217

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

超声破碎,再纯化上清检测一下BCA确定有的话可以将上清冻干浓缩一下再跑胶,或者wb
38楼2013-06-27 20:49:04
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sherrysure

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2013-06-06 23:59:39
如果有很低的表达,page上是看不出来了,而WB敏感性很强的,可以检测到很低的表达,所以page看不出来,做WB还是有意义的...

我想尝试做WB,但是做完蛋白纯化跑PAGE的时候居然什么条带也没有。。是不是真的没有表达?好难过。。。
39楼2013-07-04 08:55:03
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sherrysure

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2013-06-07 10:37:23
其实,你不能通过SDS-PAGE就判断有没有表达,有的蛋白表达量是很少的,胶上是看不出来的。如果有标签的话,先富集下就能看得出来了。或者像楼上所说的做WB。

我想尝试做WB,但是大量扩繁 做完蛋白纯化 跑PAGE的时候居然什么条带也没有。。是不是真的没有表达?好难过。。。
40楼2013-07-04 08:56:52
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