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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图
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sherrysure

银虫 (小有名气)

[求助] 我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图

这3个月一直在做蛋白表达，
但是一直没有成功。
我是这样做的：
把扩增出来的目的条带连接到pMD18TSimple，转化到Top10；
选择PCR与测序鉴定结果都正确的阳性菌液，提质粒，酶切，回收目的条带；
酶切后目的条带连接到pET30a载体，转化到Rosetta；
菌液PCR和测序鉴定结果正确的阳性菌液扩大培养，在0、2、4、6、8h取样做SDS-PAGE；
得到的结果就是没有结果



期间也试过以下表达载体：pET28b、pET30a、pET32a
选择的酶切位点是BamHI、XhoI，都对应载体图谱数过，不会存在移码的问题。
分别也都尝试过感受态：BL21、Rosetta
但是结果都是不表达，跑出来与上面类似的图

迫切寻求帮助，请求高手指导~~感激不尽！我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图
page.jpg



[ Last edited by sherrysure on 2013-6-6 at 14:47 ]
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1楼 2013-06-06 14:31:12
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xiaoweiwei121

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-11 21:13:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-06 18:20:27
恩，是忘记写了，诱导IPTG浓度0.7，又到温度30度，之前验证过这个IPTG确定是好用的，这个温度和浓度我想应该不存在问题吧。至于电泳样品的制备，个人认为应该也不会存在什么问题，因为也用别人构建成功的质粒跑过一 ...

如果有很低的表达，page上是看不出来了，而WB敏感性很强的，可以检测到很低的表达，所以page看不出来，做WB还是有意义的
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4楼2013-06-06 23:59:39
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xiaoweiwei121

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15楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-08 10:32:26
我打算先大量培养，纯化出来看看，是否可行呢？...

是可行的，但是你还要有一步就是优化纯化条件，不然有时候也是看不到纯化条带
我在昆虫细胞中表达蛋白，刚开始也是检测不到，通过纯化之后，终于看到了
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26楼2013-06-09 01:39:10
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xiaoweiwei121

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20楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-08 11:05:38
这个蛋白是以包涵体存在的。我查了一下，长时间低温诱导的作用是减少包涵体的形成。那么我的蛋白表达量是不是也会减少呢？...

个人认为吧，你还是先不要考虑这么多如温度影响表达量啊，以后蛋白量够不够啊之类的问题，现在先考虑的是如何能看到蛋白表达，只有蛋白表达了，才能说以后的话
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27楼2013-06-09 01:42:08
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xiaoweiwei121

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29楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-11 17:07:32
还想请问一下纯化条件应该如何优化呢？有哪些基本参数需要注意的地方吗？目前还没有做过纯化，但是看师兄做过，还是求指点一下细节~谢谢！！...

这个我就说不好了，不同的标签蛋白纯化也不一样，我做的是GST标签纯化的
你最好问一下你们做过的师兄吧
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30楼2013-06-12 02:48:05
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xiaoweiwei121

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引用回帖:
40楼: Originally posted by sherrysure at 2013-07-04 08:56:52
我想尝试做WB，但是大量扩繁 做完蛋白纯化 跑PAGE的时候居然什么条带也没有。。是不是真的没有表达？好难过。。。...

我做western的没有纯化，直接做的
你可以尝试一下
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48楼2013-07-05 02:01:36
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