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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图
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sherrysure

银虫 (小有名气)

[求助] 我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图

这3个月一直在做蛋白表达，
但是一直没有成功。
我是这样做的：
把扩增出来的目的条带连接到pMD18TSimple，转化到Top10；
选择PCR与测序鉴定结果都正确的阳性菌液，提质粒，酶切，回收目的条带；
酶切后目的条带连接到pET30a载体，转化到Rosetta；
菌液PCR和测序鉴定结果正确的阳性菌液扩大培养，在0、2、4、6、8h取样做SDS-PAGE；
得到的结果就是没有结果



期间也试过以下表达载体：pET28b、pET30a、pET32a
选择的酶切位点是BamHI、XhoI，都对应载体图谱数过，不会存在移码的问题。
分别也都尝试过感受态：BL21、Rosetta
但是结果都是不表达，跑出来与上面类似的图

迫切寻求帮助，请求高手指导~~感激不尽！我的蛋白序列鉴定都是正确的，可是为什么就是不表达，是为什么呢？附SDS-PAGE图
page.jpg



[ Last edited by sherrysure on 2013-6-6 at 14:47 ]
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1楼 2013-06-06 14:31:12
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-06 18:20:27
恩，是忘记写了，诱导IPTG浓度0.7，又到温度30度，之前验证过这个IPTG确定是好用的，这个温度和浓度我想应该不存在问题吧。至于电泳样品的制备，个人认为应该也不会存在什么问题，因为也用别人构建成功的质粒跑过一 ...

将IPTG和温度都设定梯度筛选，试试吧，一般都要设梯度筛选，你的条件是比较大众化的，有的不一定合适。
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8楼2013-06-07 16:37:07
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sherrysure(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-07 01:50:57
没有提到诱导，应该只是忘了写吧？

个人觉得首先需要明确的是并不是所有的外源基因在某一宿主菌内都能得到成功表达。
楼主的问题我觉得可以这么验证一下：
1. 先把操作讲清楚些，比如表达时可有设置阴性对照，电泳样品是如何制样的？
2. 可以先进行WB分析一下。
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小兵一个
2楼2013-06-06 16:48:10
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by linxt2005 at 2013-06-06 16:48:10
没有提到诱导，应该只是忘了写吧？

个人觉得首先需要明确的是并不是所有的外源基因在某一宿主菌内都能得到成功表达。
楼主的问题我觉得可以这么验证一下：
1. 先把操作讲清楚些，比如表达时可有设置阴性对照， ...

恩，是忘记写了，诱导IPTG浓度0.7，又到温度30度，之前验证过这个IPTG确定是好用的，这个温度和浓度我想应该不存在问题吧。至于电泳样品的制备，个人认为应该也不会存在什么问题，因为也用别人构建成功的质粒跑过一次PAGE，结果是正常的，所以我想因该可以排除试剂和个人操作原因吧。

上面的PAGE图从右到左分别是Marker,0,2,4,6,8h。
之前也跑过空载，结果也是一样的。
至于WB，目前还没有试过，请问page没有结果的话WB怎么分析呢？
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3楼2013-06-06 18:20:27
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-11 21:13:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by sherrysure at 2013-06-06 18:20:27
恩，是忘记写了，诱导IPTG浓度0.7，又到温度30度，之前验证过这个IPTG确定是好用的，这个温度和浓度我想应该不存在问题吧。至于电泳样品的制备，个人认为应该也不会存在什么问题，因为也用别人构建成功的质粒跑过一 ...

如果有很低的表达，page上是看不出来了，而WB敏感性很强的，可以检测到很低的表达，所以page看不出来，做WB还是有意义的
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4楼2013-06-06 23:59:39
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