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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合PCR
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wpwrn

银虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR

两个片段进行融合，一个不到200.一个2000多，怎么都容不上去？怎么办？
我的做法CR产物各1ul,退火程序为　　94℃ 5min变性，进入PCR循环：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min30s，10个循环，最后延伸72℃ 5min。
然后加引物
实在是容不出来，求助，救命啊
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联系方式QQ:350479708
1楼 2013-05-28 21:20:20
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回帖置顶 ( 共有2个 )

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 02:00:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 02:00:33
在楼上的建议的基础上:
检查融合前的PCR程序, 确认用的是不在末端加A的聚合酶
检查预计融合的地方, 两个片段重叠是不是足够长, 否则要把退火温度降下来
检查引物(最远端的两个)是不是加了
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wpwrn
3楼2013-05-28 22:57:57
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-30 21:59:41
gyesang: 回帖置顶 2013-05-30 21:59:44
引用回帖:
10楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 13:30:23
现在酶不是问题，能不能给点实用性的建议，怎么才能最简单融合出来...

你第一步产率怎么样？
另外我可以明确地说酶是问题，尤其是模板比较长，二级结构比较多（包括高GC）的情况下，不同的酶差别不是一点。


“两个片段PCR之后要纯化吗”
当然要纯化，如果有杂带还要割胶

我做的时候开始就加引物的，没遇到过任何问题。另外你设计引物时候自身的dimer和二级结构倾向怎么样，这个如果出现在融合区域，影响比较大。
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23楼2013-05-30 21:15:12
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普通回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
10个循环太少了。至少25.
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wpwrn
2楼2013-05-28 21:52:20
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-05-28 21:52:20
10个循环太少了。至少25.

退火成模板也需要25个循环吗？？我加完引物是30个循环
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4楼2013-05-29 09:45:48
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-28 22:57:57
在楼上的建议的基础上:
检查融合前的PCR程序, 确认用的是不在末端加A的聚合酶
检查预计融合的地方, 两个片段重叠是不是足够长, 否则要把退火温度降下来
检查引物(最远端的两个)是不是加了

我用的是全世金的FASTER PFU ,产物是平末端，这个有影响吗？
我是分两步的，第一步退火成模板，10个循环，不加引物，第二步，退货模板加1ul,加两端引物，30个循环，怎么也出不来
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5楼2013-05-29 09:58:42
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银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-28 22:57:57
在楼上的建议的基础上:
检查融合前的PCR程序, 确认用的是不在末端加A的聚合酶
检查预计融合的地方, 两个片段重叠是不是足够长, 否则要把退火温度降下来
检查引物(最远端的两个)是不是加了

重叠部分有35个碱基，还有一个是41个碱基，重叠部分退火温度都是很高的
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6楼2013-05-29 10:00:37
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 17:59:25
好吧，我建议PCR使用 Phusion 或Q5（NEB）其极速，扩增效率高，至于pfu我一般认为超过2000的片段这个酶就有局限性了，扩增效率比较低。如果一定要用这个传统的PFU，可以试试touch-down。
实验要改革，使用最新的实验试剂！
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7楼2013-05-29 11:11:14
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-30 21:57:51
引用回帖:
4楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 09:45:48
退火成模板也需要25个循环吗？？我加完引物是30个循环...

transgene fastpfu足够了。我一般情况是两端引物和两个待重组片段一起加进去。直接走PCR程序，25个循环，成功率接近100%。个别需要调整优化。
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8楼2013-05-29 12:17:33
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银虫 (初入文坛)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-05-29 12:17:33
transgene fastpfu足够了。我一般情况是两端引物和两个待重组片段一起加进去。直接走PCR程序，25个循环，成功率接近100%。个别需要调整优化。...

两个片段PCR之后要纯化吗？同时加两个片段及其引物，两片段各加多少的量？有没有什么浓度比或者摩尔比的吗？
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9楼2013-05-29 13:26:05
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银虫 (初入文坛)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-29 11:11:14
好吧，我建议PCR使用 Phusion 或Q5（NEB）其极速，扩增效率高，至于pfu我一般认为超过2000的片段这个酶就有局限性了，扩增效率比较低。如果一定要用这个传统的PFU，可以试试touch-down。
实验要改革，使用最新的实 ...

现在酶不是问题，能不能给点实用性的建议，怎么才能最简单融合出来
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10楼2013-05-29 13:30:23
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