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小love肖

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-30 21:59:17
PCR产物各1ul(浓度要低,胶回收产物大概5ng/ul),进入PCR循环:94℃ 5min变性 ,94℃ 30s,55℃或者50℃ 30s,72℃ 2min30s,3个循环后加正反向引物继续扩增22个循环,不用太多了,建议PCR使用 Phusion酶,pfu要是有突变了也很麻烦的
21楼2013-05-30 14:03:45
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-30 10:42:44
分子数是跟哪个概念一个意思?有人说浓度一致,有人说摩尔比一样?我用核酸仪测出来单位是ng/ul,那以ng/ul为标准该怎么加啊?...

分子数是一个不严谨的概念,或许说摩尔数更准确。如果你是ng/μl单位的话,如果在相同摩尔数的情况下,可以粗略的认为两者的浓度为10:1,片段端的浓度为1。
22楼2013-05-30 15:30:13
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-30 21:59:41
gyesang: 回帖置顶 2013-05-30 21:59:44
引用回帖:
10楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 13:30:23
现在酶不是问题,能不能给点实用性的建议,怎么才能最简单融合出来...

你第一步产率怎么样?
另外我可以明确地说酶是问题,尤其是模板比较长,二级结构比较多(包括高GC)的情况下,不同的酶差别不是一点。


“两个片段PCR之后要纯化吗”
当然要纯化,如果有杂带还要割胶

我做的时候开始就加引物的,没遇到过任何问题。另外你设计引物时候自身的dimer和二级结构倾向怎么样,这个如果出现在融合区域,影响比较大。
23楼2013-05-30 21:15:12
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 13:26:05
两个片段PCR之后要纯化吗?同时加两个片段及其引物,两片段各加多少的量?有没有什么浓度比或者摩尔比的吗?...

我的做法是两片段纯化,引物按照正常量加,两片段纯化后,不稀释,直接加1ul(PCR体系50ul,纯化时30ul重蒸水洗脱)。
24楼2013-05-30 22:55:35
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横眉

木虫 (正式写手)

引用回帖:
19楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-30 11:09:34
小片段多加一点,那二者什么关系?等浓度还是等摩尔??...

PCR不需要那么精确地  你都试试 短片段多加很多,或者长片段多加很多  还有你也换酶试试,有几种高保真酶吧 Taq酶也试试,本来就是原理很简单的东西,换换条件也许就出来了

都试了还出不来,再说!
25楼2013-05-30 23:19:09
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横眉

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

对了 试试片段回收胶放一个管里收,产物直接当模板做第一步也可以试试
26楼2013-05-30 23:21:11
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465091999

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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你用的是两步法融合吧,之前第一步不加引物先让两个片段融合,个人认为你的退火温度有点高,不利于两个片段的融合,建议你将第一步反应的退火温度降到40度,增强片段配对的成功率。
我有我世界!
27楼2013-05-31 13:03:20
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zxbz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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建议:
两个片段等摩尔加入,然后程序设定:95,3min;94,2min;48,5min,72,2min,15个循环,72,10min。
然后用巢式引物扩增(如果你的目的片段就是这200+2000,建议你拿到的两个片段都再稍微长一点,最后用巢式引物拉出你的目的大小片段)
28楼2013-05-31 14:05:47
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xiaodao1

金虫 (小有名气)

其实我嫌贵,用taq酶也弄出来过,虽然加A了,但是却都弄成功了。不过最好是别这样。你如果这样不行,试试把引物直接加到体系,直接如普通PCR扩,试试看。但是每个片段P出来记得先胶回收。
29楼2013-05-31 15:21:03
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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你融合的片段纯化了吗?循环数有点少了啊
30楼2013-05-31 15:58:17
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