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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合PCR
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小love肖

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-30 21:59:17
PCR产物各1ul（浓度要低，胶回收产物大概5ng/ul),进入PCR循环：94℃ 5min变性 ，94℃ 30s，55℃或者50℃ 30s，72℃ 2min30s，3个循环后加正反向引物继续扩增22个循环，不用太多了，建议PCR使用 Phusion酶，pfu要是有突变了也很麻烦的
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21楼2013-05-30 14:03:45
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-30 10:42:44
分子数是跟哪个概念一个意思？有人说浓度一致，有人说摩尔比一样？我用核酸仪测出来单位是ng/ul，那以ng/ul为标准该怎么加啊？...

分子数是一个不严谨的概念，或许说摩尔数更准确。如果你是ng/μl单位的话，如果在相同摩尔数的情况下，可以粗略的认为两者的浓度为10:1，片段端的浓度为1。
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22楼2013-05-30 15:30:13
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-30 21:59:41
gyesang: 回帖置顶 2013-05-30 21:59:44
引用回帖:
10楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 13:30:23
现在酶不是问题，能不能给点实用性的建议，怎么才能最简单融合出来...

你第一步产率怎么样？
另外我可以明确地说酶是问题，尤其是模板比较长，二级结构比较多（包括高GC）的情况下，不同的酶差别不是一点。


“两个片段PCR之后要纯化吗”
当然要纯化，如果有杂带还要割胶

我做的时候开始就加引物的，没遇到过任何问题。另外你设计引物时候自身的dimer和二级结构倾向怎么样，这个如果出现在融合区域，影响比较大。
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23楼2013-05-30 21:15:12
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 13:26:05
两个片段PCR之后要纯化吗？同时加两个片段及其引物，两片段各加多少的量？有没有什么浓度比或者摩尔比的吗？...

我的做法是两片段纯化，引物按照正常量加，两片段纯化后，不稀释，直接加1ul（PCR体系50ul，纯化时30ul重蒸水洗脱）。
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24楼2013-05-30 22:55:35
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横眉

木虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-30 11:09:34
小片段多加一点，那二者什么关系？等浓度还是等摩尔？？...

PCR不需要那么精确地  你都试试 短片段多加很多，或者长片段多加很多  还有你也换酶试试，有几种高保真酶吧 Taq酶也试试，本来就是原理很简单的东西，换换条件也许就出来了

都试了还出不来，再说！
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25楼2013-05-30 23:19:09
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横眉

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

对了 试试片段回收胶放一个管里收，产物直接当模板做第一步也可以试试
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26楼2013-05-30 23:21:11
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465091999

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的是两步法融合吧，之前第一步不加引物先让两个片段融合，个人认为你的退火温度有点高，不利于两个片段的融合，建议你将第一步反应的退火温度降到40度，增强片段配对的成功率。
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我有我世界！
27楼2013-05-31 13:03:20
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zxbz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议：
两个片段等摩尔加入，然后程序设定：95,3min；94，2min；48,5min，72,2min，15个循环，72,10min。
然后用巢式引物扩增（如果你的目的片段就是这200+2000，建议你拿到的两个片段都再稍微长一点，最后用巢式引物拉出你的目的大小片段）
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28楼2013-05-31 14:05:47
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xiaodao1

金虫 (小有名气)
其实我嫌贵，用taq酶也弄出来过，虽然加A了，但是却都弄成功了。不过最好是别这样。你如果这样不行，试试把引物直接加到体系，直接如普通PCR扩，试试看。但是每个片段P出来记得先胶回收。
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29楼2013-05-31 15:21:03
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你融合的片段纯化了吗？循环数有点少了啊
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30楼2013-05-31 15:58:17
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