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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合PCR
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wpwrn

银虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR

两个片段进行融合，一个不到200.一个2000多，怎么都容不上去？怎么办？
我的做法CR产物各1ul,退火程序为　　94℃ 5min变性，进入PCR循环：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min30s，10个循环，最后延伸72℃ 5min。
然后加引物
实在是容不出来，求助，救命啊
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联系方式QQ:350479708
1楼 2013-05-28 21:20:20
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-30 21:59:41
gyesang: 回帖置顶 2013-05-30 21:59:44
引用回帖:
10楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 13:30:23
现在酶不是问题，能不能给点实用性的建议，怎么才能最简单融合出来...

你第一步产率怎么样？
另外我可以明确地说酶是问题，尤其是模板比较长，二级结构比较多（包括高GC）的情况下，不同的酶差别不是一点。


“两个片段PCR之后要纯化吗”
当然要纯化，如果有杂带还要割胶

我做的时候开始就加引物的，没遇到过任何问题。另外你设计引物时候自身的dimer和二级结构倾向怎么样，这个如果出现在融合区域，影响比较大。
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23楼2013-05-30 21:15:12
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
10个循环太少了。至少25.
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wpwrn
2楼2013-05-28 21:52:20
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 02:00:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 02:00:33
在楼上的建议的基础上:
检查融合前的PCR程序, 确认用的是不在末端加A的聚合酶
检查预计融合的地方, 两个片段重叠是不是足够长, 否则要把退火温度降下来
检查引物(最远端的两个)是不是加了
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wpwrn
3楼2013-05-28 22:57:57
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-05-28 21:52:20
10个循环太少了。至少25.

退火成模板也需要25个循环吗？？我加完引物是30个循环
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联系方式QQ:350479708
4楼2013-05-29 09:45:48
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