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wpwrn

银虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR

两个片段进行融合,一个不到200.一个2000多,怎么都容不上去?怎么办?
我的做法CR产物各1ul,退火程序为  94℃ 5min变性,进入PCR循环:94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 2min30s,10个循环,最后延伸72℃ 5min。
然后加引物
实在是容不出来,求助,救命啊
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联系方式QQ:350479708
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wpwrn

银虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-05-29 12:17:33
transgene fastpfu足够了。我一般情况是两端引物和两个待重组片段一起加进去。直接走PCR程序,25个循环,成功率接近100%。个别需要调整优化。...

两个片段PCR之后要纯化吗?同时加两个片段及其引物,两片段各加多少的量?有没有什么浓度比或者摩尔比的吗?
联系方式QQ:350479708
9楼2013-05-29 13:26:05
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查看全部 31 个回答

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
10个循环太少了。至少25.

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2013-05-28 21:52:20
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-29 02:00:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 02:00:33
在楼上的建议的基础上:
检查融合前的PCR程序, 确认用的是不在末端加A的聚合酶
检查预计融合的地方, 两个片段重叠是不是足够长, 否则要把退火温度降下来
检查引物(最远端的两个)是不是加了

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2013-05-28 22:57:57
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wpwrn

银虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-05-28 21:52:20
10个循环太少了。至少25.

退火成模板也需要25个循环吗??我加完引物是30个循环
联系方式QQ:350479708
4楼2013-05-29 09:45:48
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