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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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wpwrn

银虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR

两个片段进行融合，一个不到200.一个2000多，怎么都容不上去？怎么办？
我的做法CR产物各1ul,退火程序为　　94℃ 5min变性，进入PCR循环：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min30s，10个循环，最后延伸72℃ 5min。
然后加引物
实在是容不出来，求助，救命啊
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联系方式QQ:350479708
1楼 2013-05-28 21:20:20
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-30 21:57:51
引用回帖:
4楼: Originally posted by wpwrn at 2013-05-29 09:45:48
退火成模板也需要25个循环吗？？我加完引物是30个循环...

transgene fastpfu足够了。我一般情况是两端引物和两个待重组片段一起加进去。直接走PCR程序，25个循环，成功率接近100%。个别需要调整优化。
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wpwrn
8楼2013-05-29 12:17:33
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
10个循环太少了。至少25.
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wpwrn
2楼2013-05-28 21:52:20
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 02:00:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 02:00:33
在楼上的建议的基础上:
检查融合前的PCR程序, 确认用的是不在末端加A的聚合酶
检查预计融合的地方, 两个片段重叠是不是足够长, 否则要把退火温度降下来
检查引物(最远端的两个)是不是加了
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wpwrn
3楼2013-05-28 22:57:57
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-05-28 21:52:20
10个循环太少了。至少25.

退火成模板也需要25个循环吗？？我加完引物是30个循环
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联系方式QQ:350479708
4楼2013-05-29 09:45:48
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查看全部 31 个回答
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