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roomofxw

木虫 (正式写手)
PCR拼接应该不是很难，但是如果没把握做出来的话
分析基因，找个合适的酶切位点，用酶切连接的方法
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wpwrn
11楼2013-05-29 13:58:46
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横眉

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最后引物是扩不出来还是扩出来大小不对？ 可以尝试小片段体积加多一些  按2：1试试
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wpwrn
12楼2013-05-29 14:20:46
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kk26

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我不建议添加片段互为模板 进行一次扩增

直接以混合模板（摩尔体积比相同）为引物，进行普通pcr扩增即可
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wpwrn
坚持的保持一种热爱！
13楼2013-05-29 15:38:41
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-05-29 16:12:57
两个片段长度相差太大了，考虑调整一下两者的比例，分子数接近1:1效果可能会好一些。至于加引物前的循环次数，我一般15个，感觉10个应该也可以。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

wpwrn
14楼2013-05-29 15:53:41
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by roomofxw at 2013-05-29 13:58:46
PCR拼接应该不是很难，但是如果没把握做出来的话
分析基因，找个合适的酶切位点，用酶切连接的方法

那中间岂不是有酶切位点了，会影响的吧
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联系方式QQ:350479708
15楼2013-05-30 09:55:34
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by joan198108 at 2013-05-29 15:53:41
两个片段长度相差太大了，考虑调整一下两者的比例，分子数接近1:1效果可能会好一些。至于加引物前的循环次数，我一般15个，感觉10个应该也可以。

分子数是跟哪个概念一个意思？有人说浓度一致，有人说摩尔比一样？我用核酸仪测出来单位是ng/ul，那以ng/ul为标准该怎么加啊？
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16楼2013-05-30 10:42:44
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xiaoapple

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
17楼2013-05-30 11:02:22
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by kk26 at 2013-05-29 15:38:41
我不建议添加片段互为模板 进行一次扩增

直接以混合模板（摩尔体积比相同）为引物，进行普通pcr扩增即可

那你的意思是分两步还是一步？？进行普通PCR模板是谁？两个片段的比例怎么定？？
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联系方式QQ:350479708
18楼2013-05-30 11:08:16
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wpwrn

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 横眉 at 2013-05-29 14:20:46
最后引物是扩不出来还是扩出来大小不对？ 可以尝试小片段体积加多一些  按2：1试试

小片段多加一点，那二者什么关系？等浓度还是等摩尔？？
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19楼2013-05-30 11:09:34
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-30 21:59:04
SOEing PCR对引物要求很高，不知道你两侧引物的Tm值多少，overlap区的Tm值又是多少，最好一致。两个片段都需要纯化，摩尔数相当。我觉得最大的问题就是引物的设计，但如果实在做不出来，可以用touch down PCR。
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20楼2013-05-30 12:15:16
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