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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T载体自连
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

[求助] T载体自连

做蓝白斑筛选的时候，空白使用不含目的片段的T载体+感受态+SOC培养基做的，但是每次平板里面长出来的白斑和蓝斑都不少，绝大部分是蓝斑。抗生素、X-GAL、IPTG都没有问题，这是载体自连吗？有什么方法减少载体自连的？
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1楼 2013-05-27 21:25:15
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protura

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-05-28 19:47:55
个人经验，空白对照中的载体自连是难以避免的，蓝白斑筛选并不绝对，有时做克隆时挑取的白斑也是阴性。只好每次加大挑取菌落的数量，比如3-5个，确保能挑到阳性克隆。
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2楼2013-05-28 08:23:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说明T载体质量不行了。是不是放时间久了？
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3楼2013-05-28 08:23:22
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by protura at 2013-05-28 08:23:03
个人经验，空白对照中的载体自连是难以避免的，蓝白斑筛选并不绝对，有时做克隆时挑取的白斑也是阴性。只好每次加大挑取菌落的数量，比如3-5个，确保能挑到阳性克隆。

我上次一次性挑了20个，结果全是假阳性
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4楼2013-05-28 08:29:56
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-28 08:23:22
说明T载体质量不行了。是不是放时间久了？

也不久啊。今年一月份才买的，-20度放的
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5楼2013-05-28 08:30:24
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protura

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-05-28 08:29:56
我上次一次性挑了20个，结果全是假阳性...

你太厉害，我最多只做5个，如果5个都是假阳性，很可能这次转化失败了，考虑要重来一次的。
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6楼2013-05-28 08:41:36
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by protura at 2013-05-28 08:41:36
你太厉害，我最多只做5个，如果5个都是假阳性，很可能这次转化失败了，考虑要重来一次的。...

因为之前挑的少，所以上次就多挑了一点。转化失败会是感受态的问题吗？我感受态是自己制的，不是买的
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7楼2013-05-28 08:44:03
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protura

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-05-28 08:44:03
因为之前挑的少，所以上次就多挑了一点。转化失败会是感受态的问题吗？我感受态是自己制的，不是买的...

我以前也自己做过感受态，一次很一大批，做完之后验证一下，没问题的话就可以使用了。不过感受态确实挺便宜的，买商业化的还是不错的选择。
转化失败不绝对是感受态的问题，也可能是载体出来问题、扩增片段不易转化，等等，可以逐个排除，建议先从换感受态开始吧。
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8楼2013-05-28 08:48:08
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-05-28 19:48:21
蓝白斑的颜色变化比菌落长得慢，你可以在转化完了，菌长好了之后，放在四度1到2天，这样没来得及变成蓝色的假阳性就都变成蓝色了，然后你再看看效率。只要泛蓝，就是蓝斑，再挑白斑，成功率高点，如果都是蓝的，那就是T载体的问题或者是你insert的问题，跑个电泳确认一下insert的质量，而且insert往死了多加没事的。。。。。。。。。。。
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
9楼2013-05-28 08:49:05
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 实心小白菜 at 2013-05-28 08:49:05
蓝白斑的颜色变化比菌落长得慢，你可以在转化完了，菌长好了之后，放在四度1到2天，这样没来得及变成蓝色的假阳性就都变成蓝色了，然后你再看看效率。只要泛蓝，就是蓝斑，再挑白斑，成功率高点，如果都是蓝的，那就 ...

谢谢，我一般都是4度放半天的，1-2天会不会太久了，X-gal都降解了
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10楼2013-05-28 17:03:25
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