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木虫 (著名写手)

[求助] T载体自连

做蓝白斑筛选的时候，空白使用不含目的片段的T载体+感受态+SOC培养基做的，但是每次平板里面长出来的白斑和蓝斑都不少，绝大部分是蓝斑。抗生素、X-GAL、IPTG都没有问题，这是载体自连吗？有什么方法减少载体自连的？

1楼 2013-05-27 21:25:15

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木虫 (小有名气)

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-05-28 19:47:55

个人经验，空白对照中的载体自连是难以避免的，蓝白斑筛选并不绝对，有时做克隆时挑取的白斑也是阴性。只好每次加大挑取菌落的数量，比如3-5个，确保能挑到阳性克隆。

2楼2013-05-28 08:23:03

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木虫 (小有名气)

引用回帖:

4楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-05-28 08:29:56
我上次一次性挑了20个，结果全是假阳性...

你太厉害，我最多只做5个，如果5个都是假阳性，很可能这次转化失败了，考虑要重来一次的。

6楼2013-05-28 08:41:36

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木虫 (小有名气)

引用回帖:

7楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-05-28 08:44:03
因为之前挑的少，所以上次就多挑了一点。转化失败会是感受态的问题吗？我感受态是自己制的，不是买的...

我以前也自己做过感受态，一次很一大批，做完之后验证一下，没问题的话就可以使用了。不过感受态确实挺便宜的，买商业化的还是不错的选择。
转化失败不绝对是感受态的问题，也可能是载体出来问题、扩增片段不易转化，等等，可以逐个排除，建议先从换感受态开始吧。

8楼2013-05-28 08:48:08

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