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求动物（猪牛羊鸡鸭）细胞线粒体的提取分离方法
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要完整的线粒体，不是线粒体DNA或者其他组分，谢谢了 |
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志子
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制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。 举例：新鲜的猪肝脏 1. 制备猪肝细胞匀浆。实验前购买新鲜猪肝脏备用。 割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎， 用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 2. 差速离心。 先将5ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入5ml肝匀浆使其覆盖于上层，用高速冷冻离心机进行差速离心。 3. 滤液经700×g离心10min，分离核和杂质沉淀。 4. 取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。 5. 沉淀经再次洗涤、离心后，即可得到纯度较高的线粒体。 6. 分离物鉴定。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持 细胞器的结构和酶的活性，在 pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。 整个操作过程应注意使样品保持 4 ℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿 B （ Janus green B ）是对线粒体专一的活细 胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体 的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色， 而细胞质中的染 料被还原成无色。 |
2楼2013-05-25 02:09:25