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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 包涵体复性
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 包涵体复性

最近做两个蛋白，复性的时候遇到问题，换了好几个复性条件，结果总是在2MU的时候完全沉淀。上次做出来了用的复性Buffer为20mMTris，0.015%SDS，1mMEDTA和分别的2MU、1MU、0MU
首先是进行稀释1倍（用枪逐滴加入），然后分别依次透析
今天重复做，不知道为什么总是在稀释复性的时候就沉淀了，为什么
请大家指教
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2013-05-22 16:03:58
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2013-05-24 11:22:59
我上次成功复性的那次，复性完成后蛋白的浓度是0.44mg/ml，因为我现在是在公司上班，做的要能用于产品且不复杂，所以多浓度有一点的要求，如果浓度太低就不能用于胶体金了。只要能重复我之前的操作其实结果还是挺好 ...

可以低浓度复兴后再浓缩啊
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10楼2013-05-24 14:59:39
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普通回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
怎么没人回答呢？自己顶一下
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
2楼2013-05-23 14:32:12
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-05-24 09:19:52
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-03 13:45:59
并不是所有的蛋白都可以稀释复性。
有一些蛋白分子无法越过中间态而转向于聚集沉淀，这是正常的。通常透析时浓度在0.1一下，可以加入0.5M arg抑制分子聚集，进而使复性向正确折叠的方向移动。
你的蛋白天然状态有没有二硫键呢？这个你要确定，因为有二硫键的话你要用氧化还原体系来形成正确的链内二硫键。
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475502411
3楼2013-05-24 08:21:00
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475502411

铜虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-24 07:21:00
并不是所有的蛋白都可以稀释复性。
有一些蛋白分子无法越过中间态而转向于聚集沉淀，这是正常的。通常透析时浓度在0.1一下，可以加入0.5M arg抑制分子聚集，进而使复性向正确折叠的方向移动。
你的蛋白天然状态有 ...

终于有人回复我了，谢谢了
我之前按照个体系成功复性过一次，活性也很高，但是就仅仅一次，现在做了三次都重复不出来，都是1倍稀释复性的时候就沉淀了，也不知道为什么？
这个蛋白本身有7个二硫键
但是37度培养一般是包涵体一般是上清表达，30度差不多都是上清表达了，但是挂不上Ni柱，我就把他表达成沉淀复性了，因为我刚开始想本身是上清表达复性应该比较容易的
请指教
谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
4楼2013-05-24 09:19:33
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生物小通

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+2 2013-05-30 11:51:14
复性成功是怎么确定的？我来学习一下，你的蛋白可溶性表达这么多，真心幸福啊。我的蛋白也是挂不到Ni柱上，后来换用了磁珠纯化，虽然效率有点低，但是纯化出来了，纯度也可以，建议尝试。
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学习，进步
5楼2013-05-24 09:42:52
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-05-30 11:51:27
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-03 13:47:59
引用回帖:
4楼: Originally posted by 475502411 at 2013-05-24 09:19:33
终于有人回复我了，谢谢了
我之前按照个体系成功复性过一次，活性也很高，但是就仅仅一次，现在做了三次都重复不出来，都是1倍稀释复性的时候就沉淀了，也不知道为什么？
这个蛋白本身有7个二硫键
但是37度培养 ...

有七个二硫键，在之前透析的时候如果没有还原性-sh存在，你的蛋白很容易聚集沉淀。
建议：在>2m尿素之前的透析中加入2mm dtt防止聚集形成多聚体。而你破碎溶解包涵体的时候更要加。
在2m尿素的时候，蛋白浓度调到0.2mg/ml左右，透析到含有10mm GSh,1mm gssg（也叫gssh）中，4度过夜。然后再透析到更低浓度的尿素中。谢谢。
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6楼2013-05-24 10:00:16
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 生物小通 at 2013-05-24 08:42:52
复性成功是怎么确定的？我来学习一下，你的蛋白可溶性表达这么多，真心幸福啊。我的蛋白也是挂不到Ni柱上，后来换用了磁珠纯化，虽然效率有点低，但是纯化出来了，纯度也可以，建议尝试。

是通过ELISA和胶体金确定的蛋白活性
想请教一下，磁珠纯化时怎么样的，能不能具体说说，或者给点资料什么的，我们实验室真没做过，我还是第一次听说呢
谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
7楼2013-05-24 11:16:57
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-24 09:00:16
有七个二硫键，在之前透析的时候如果没有还原性-sh存在，你的蛋白很容易聚集沉淀。
建议：在>2m尿素之前的透析中加入2mm dtt防止聚集形成多聚体。而你破碎溶解包涵体的时候更要加。
在2m尿素的时候，蛋白浓度 ...

我上次成功复性的那次，复性完成后蛋白的浓度是0.44mg/ml，因为我现在是在公司上班，做的要能用于产品且不复杂，所以多浓度有一点的要求，如果浓度太低就不能用于胶体金了。只要能重复我之前的操作其实结果还是挺好的，但就是不行，很郁闷。我之前试过您给我说的这个复性条件，但是到2M的时候就完全沉淀了，真是很心疼啊

我想想想办法上清纯化，现在挂不上柱，两端都有His标签，45KD，请指教
谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
8楼2013-05-24 11:22:59
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+1, ★有帮助 2013-05-30 11:54:34
能做上清就做上清啊，包涵体不是一般的困难，现在好像还没有人能突破，还是想办法做上清吧
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不想说什么，，，，
9楼2013-05-24 14:34:38
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