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陈正启

铁虫 (初入文坛)

[求助] 如何判断ORF是不是完整的

想根据转录组来做ORF全长的克隆，但不是不确定怎么判断ORF是不是完整的，请教各位！
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1楼 2013-05-02 14:04:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
陈正启(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 08:21:58
gyesang: 回帖置顶 2013-05-21 08:22:01
1 BLAST分析基本上可以确定你拿到的序列(CDNA序列,基因组的可能还要复杂一点,下同)所包含的本基因家族的主体结构域是不是都存在,这是第一个证据.
2 BLAST同时可以提供这个基因家族核酸序列的长度,如果都与你拿到的orf长度也差不多,可以比较放心了.
3 3'端可以通过软件分析ORF终止位点来确定,这个一般不会错.不放心就做一个3'RACE,比较简单且低成本.
4 有时候你的序列分析显示这个基因的全部保守结构域都已经在了,但是它有可能在5'段还有一段..ATG作为翻译起始位点,可以作为一个证据,但是不保证前面就没有其它的新的ATG了.你要仔细的分析,你的ATG起始位点之后的翻译的蛋白和这个基因家族大体相同,而且在atg之前无论从哪个碱基开始,都会提前找到终止密码,且翻译的蛋白短,不能很好的匹配这个基因家族,那就可以确定这个ATG是ORF起始的地方了.你的ORF的5'也就搞定了.
5 如果从你拿到的序列的第1,2 或者第三个碱基开始都可以读通,并且包含了你找到的ATG, 翻译出来的序列也确实是这个家族的,那就有可能前面还有一个ATG.最保险的是连5'RACE都做了. 5'RACE稍微费点劲儿,但是结果要可靠些.
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9楼2013-05-14 10:20:14
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ivysmile

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
陈正启(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 19:24:39
在起始密码子之前有个lkozak序列，在终止密码子之后有AATAA 和polyA，基本就确定是完整的了
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10楼2013-05-14 11:21:38
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普通回帖

Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这是个好问题，先去比对一下吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-05-04 00:58:20
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
陈正启(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-08 22:52:37
把你的基因序列放在clonemessage中，可以帮你寻找ORF
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3楼2013-05-04 20:46:54
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-05-05 10:48:05
可以去NCBI网站，使用blast工具里的blastx做比对，和数据库里面已知的同源蛋白做比较，应该可以获得一些关于你的ORF是否是全长的信息。如果你的ORF和比对上的同源蛋白序列完全比对上了，基本能都说明ORF是完整的了。
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Stop fighting,let it flow.
4楼2013-05-04 21:38:55
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

★
陈正启(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-08 22:52:53
嗯  现在有ORF的在线预测软件，你可以搜一下
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好好学习，天天向上
5楼2013-05-06 08:50:34
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zwf2005

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

提取RNA，然后反转录cDNA，以此为PCR为模版进行PCR或者侧翼PCR
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generesource
6楼2013-05-08 22:12:23
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sdynyam

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
陈正启(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 08:21:33
原核生物基因或真核生物cDNA具有ORF开始和结束的位置特征，适合选用getorf工具。二真核生物基因具有内含子剪切位点，适合选用GENSCAN，可同时预测ORF和基因的内部结构。
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7楼2013-05-13 20:19:01
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陈正启

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dayulee at 2013-05-06 08:50:34
嗯  现在有ORF的在线预测软件，你可以搜一下

这个是有，问题是预测出来的ORF，你怎么就肯定它就是全长的呢，
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8楼2013-05-14 09:40:42
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