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陈正启

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 如何判断ORF是不是完整的

想根据转录组来做ORF全长的克隆，但不是不确定怎么判断ORF是不是完整的，请教各位！

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1楼 2013-05-02 14:04:29

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grape_vine

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
陈正启(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 08:21:58
gyesang: 回帖置顶 2013-05-21 08:22:01

1 BLAST分析基本上可以确定你拿到的序列(CDNA序列,基因组的可能还要复杂一点,下同)所包含的本基因家族的主体结构域是不是都存在,这是第一个证据.
2 BLAST同时可以提供这个基因家族核酸序列的长度,如果都与你拿到的orf长度也差不多,可以比较放心了.
3 3'端可以通过软件分析ORF终止位点来确定,这个一般不会错.不放心就做一个3'RACE,比较简单且低成本.
4 有时候你的序列分析显示这个基因的全部保守结构域都已经在了,但是它有可能在5'段还有一段..ATG作为翻译起始位点,可以作为一个证据,但是不保证前面就没有其它的新的ATG了.你要仔细的分析,你的ATG起始位点之后的翻译的蛋白和这个基因家族大体相同,而且在atg之前无论从哪个碱基开始,都会提前找到终止密码,且翻译的蛋白短,不能很好的匹配这个基因家族,那就可以确定这个ATG是ORF起始的地方了.你的ORF的5'也就搞定了.
5 如果从你拿到的序列的第1,2 或者第三个碱基开始都可以读通,并且包含了你找到的ATG, 翻译出来的序列也确实是这个家族的,那就有可能前面还有一个ATG.最保险的是连5'RACE都做了. 5'RACE稍微费点劲儿,但是结果要可靠些.