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淡墨melon

铜虫 (小有名气)

[求助] 新手SSR,不会区分目的条带,求帮助

1、SSR体系
    10×Taq Buffer(15mM/L Mgcl2)    1.5ul
    5 umol/L 引物                              各1ul
   2U/ul 酶                                       0.5ul
    2.5 dNTPs                                      1ul
    50ng/ul DNA                                 0.4ul
   补水至  15ul

    扩增程序
            94℃  3min
                      94℃  30s
                      55℃  60s
                       72℃ 90s
                       循环35次
            72℃ 7min
            4℃保存
2、 跑胶是 8 %非变性聚丙烯凝胶, 280V  70min
      加3ul上样缓冲液,点样3ul
3、染色是银染法

为什么我的目的条带都聚集在一块,模糊着看不清楚。非特异性条带也多?
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活得精彩,不要有遗憾!!
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wuxingbo1986

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这是在筛引物?
2楼2013-04-29 11:02:34
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淡墨melon

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wuxingbo1986 at 2013-04-29 11:02:34
你这是在筛引物?

嗯。我在筛引物
活得精彩,不要有遗憾!!
3楼2013-04-29 16:52:39
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wuxingbo1986

银虫 (小有名气)

筛引物的话,这比较正常,条带还算比较清楚,多态性还可以的,四份DNA来筛引物是不是有些少了?如果想清楚一些的话,体系应该不用调整,复筛的时候,调整一下退火温度试试看吧。
4楼2013-04-29 21:30:41
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icepearl

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.提高退火温度
2.减少DNA模板量
3.减少上样量
再不行,就要重新设计引物。
5楼2013-04-30 00:05:57
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淡墨melon

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wuxingbo1986 at 2013-04-29 21:30:41
筛引物的话,这比较正常,条带还算比较清楚,多态性还可以的,四份DNA来筛引物是不是有些少了?如果想清楚一些的话,体系应该不用调整,复筛的时候,调整一下退火温度试试看吧。

这个已经是把退火温度提高到了57了,还是有很多的非特异性条带,我还想问一下为什么我的条带都不直呢
活得精彩,不要有遗憾!!
6楼2013-04-30 12:26:39
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淡墨melon

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by icepearl at 2013-04-30 00:05:57
1.提高退火温度
2.减少DNA模板量
3.减少上样量
再不行,就要重新设计引物。

dna模板我本身就是加很少了,总共才加20ng
活得精彩,不要有遗憾!!
7楼2013-04-30 12:27:21
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yuantii

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
淡墨melon(lqf808代发): 金币+2, 很好 2013-06-17 06:26:54
淡墨melon: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-06-21 09:34:45
从你的图发现几点问题:
凝胶有断裂现象,说明可能制胶的时候各个药品没有充分混匀,成分不均一会容易断胶;
底边很不整齐,说明琼脂糖封板的时候可能温度稍低或浓度过大,造成封板胶界面不平滑,这也是胶容易断的一个诱因;
条带差点就跑穿了,该电压下跑的时间稍长,最好是降低电压,增加电泳时间;
条带略有弥散,条带间区分不明显,可以通过降低电压使条带压的更细一些,进一步提高分辨率;
从梳孔来看,凝胶放的时间稍长,夏天气温高空气干燥,建议不要放置太长时间;
条带分辨率的问题,换用25齿的大梳子跑出来的图要漂亮得多,分辨率立马提升;
还是分辨率的问题,条件允许的话建议使用大板,泳道30cm左右的那种电泳槽,条带区分度会提高很多的。

希望对你有用。
码字不容易,内容更是经验之谈,看着赏点币吧,多谢啦
8楼2013-06-16 22:59:32
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xiaohaiyu

金虫 (正式写手)

先查看引物的目的条带大小,归类,然后再跑胶,不会出现有些还在上面,有些快跑出去了
9楼2013-06-18 21:42:50
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我不是分割线

新虫 (小有名气)

请问你用的上样缓冲液是哪种,谢谢

发自小木虫IOS客户端
10楼2017-09-07 09:53:31
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