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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 实验室分析、仪器 » 测胡萝卜多酚氧化酶遇到的问题
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西瓜猪1007

铁虫 (初入文坛)

[求助] 测胡萝卜多酚氧化酶遇到的问题

前阵子测胡萝卜多酚氧化酶活的时候遇到了如下问题：
1. 当我把酶液和底物混合在比色皿中以后，一开始吸光值正常的慢慢变大，再反应一会，吸光值逐渐变小，发现反应液开始分层。请教为什么反应液会分层。。。好纠结。。。
2. 实验室没有冷冻离心机，提取酶液的时候不冷冻离心会怎么样。。。
3. 看文献人家做实验会加PVP，这个东西的作用到底是什么？防止PPO氧化？每次做实验加PVP以后，反应液一旦混合颜色就好白好白。。吸光值太大了。。。

我的反应体系是0.5ml酶液+3ml底物（0.5M邻苯二酚溶于pH6.5 0.2M的磷酸缓冲液）

2013-04-13 17.04.57.jpg
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1楼2013-04-23 16:17:08
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 西瓜猪1007 at 2013-04-27 10:53:08
我再问一下哦~多酚氧化产颜色影响的意思是怕提取液的初始颜色太深是吗？如果我不加PVP提取的酶液，测酶活的吸光值也不是很大，是不是就可以不加PVP了？...

如果样本本身含有较多的酚类物质，在处理的过程中会产生褐色的醌。如果本身酚类含量少，初始吸光值低，当然就可以不用加PVP。
另外，如果加PVP，加入的量还要合适，因为测定PPO底物还是酚类，PVP加多了会影响测定
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12楼2013-04-27 14:25:04
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user59888

金虫 (文坛精英)

宫创始人 ------小妮

【答案】应助回帖

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1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol•L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol•L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol•L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算
以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

A 酶提取液总量（ml）
酶活力（0.01A•min－1）＝———————×———————————
0.01×反应时间 测定时酶液用量（ml）
A 酶提取液总量（ml）
酶的比活性(0.01A•g－1Fw•min)＝—————————×——————————
0.01×W×反应时间 测定时酶液用量（ml）

公式中：A — 为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。你按这个试一试，不行在交流
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此人已死，没烧纸的半夜出来喝酒
3楼2013-04-23 22:37:36
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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西瓜猪1007: 金币+2, ★有帮助 2013-04-27 10:48:02
PVP是为了去除材料中的多酚，多酚氧化会产生颜色影响测定，通常在测定植物性样品时会加
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4楼2013-04-24 16:29:47
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Alexalex19

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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可能是多酚氧化酶与底物反应了，造成该波长下底物产生的吸收减小所致，有前辈们说侧吸光度操作要在数秒内完成。愚见仅供参考
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2楼2013-04-23 17:40:24
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

离心机在离心的过程中温度会升高，而酶容易失活，如果不用冷冻离心机，测得的酶活可信度不高，会比真实值低。
如果所在的实验室没有冷冻离心机，可以找实验中心或者其他实验室借用。
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5楼2013-04-24 16:33:11
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西瓜猪1007

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Alexalex19 at 2013-04-23 17:40:24
可能是多酚氧化酶与底物反应了，造成该波长下底物产生的吸收减小所致，有前辈们说侧吸光度操作要在数秒内完成。愚见仅供参考

最近做了实验觉得是我底物浓度太高了~
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6楼2013-04-26 22:54:27
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西瓜猪1007

铁虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2013-04-24 16:33:11
离心机在离心的过程中温度会升高，而酶容易失活，如果不用冷冻离心机，测得的酶活可信度不高，会比真实值低。
如果所在的实验室没有冷冻离心机，可以找实验中心或者其他实验室借用。

冷冻离心机是不是个头都很大啊~我每次只要离心几毫升的液体~
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7楼2013-04-26 22:57:36
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西瓜猪1007

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2013-04-24 16:29:47
PVP是为了去除材料中的多酚，多酚氧化会产生颜色影响测定，通常在测定植物性样品时会加

是这样啊~怪不得加了PVP的样品颜色会变浅~太感谢你的答复了！
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8楼2013-04-26 22:58:59
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西瓜猪1007

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by user59888 at 2013-04-23 22:37:36
1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol•L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度 ...

硫酸铵的作用是？使酶沉淀下来？
另外~为什么测酶活之前儿茶酚要先保温10min呢？
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9楼2013-04-26 23:03:02
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 西瓜猪1007 at 2013-04-26 22:57:36
冷冻离心机是不是个头都很大啊~我每次只要离心几毫升的液体~...

当然有小的啦，你们做酶活多的话可以让老板给买一台嘛，国产的只要几万块钱
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10楼2013-04-27 08:13:24
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