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西瓜猪1007

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 测胡萝卜多酚氧化酶遇到的问题

前阵子测胡萝卜多酚氧化酶活的时候遇到了如下问题：
1. 当我把酶液和底物混合在比色皿中以后，一开始吸光值正常的慢慢变大，再反应一会，吸光值逐渐变小，发现反应液开始分层。请教为什么反应液会分层。。。好纠结。。。
2. 实验室没有冷冻离心机，提取酶液的时候不冷冻离心会怎么样。。。
3. 看文献人家做实验会加PVP，这个东西的作用到底是什么？防止PPO氧化？每次做实验加PVP以后，反应液一旦混合颜色就好白好白。。吸光值太大了。。。

我的反应体系是0.5ml酶液+3ml底物（0.5M邻苯二酚溶于pH6.5 0.2M的磷酸缓冲液）

2013-04-13 17.04.57.jpg

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关于测定笋的多酚氧化酶PPO活性的问题已经有14人回复

1楼2013-04-23 16:17:08

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user59888

金虫 (文坛精英)

宫创始人 ------小妮

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol•L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol•L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol•L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算
以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

A 酶提取液总量（ml）
酶活力（0.01A•min－1）＝———————×———————————
0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）
A 酶提取液总量（ml）
酶的比活性(0.01A•g－1Fw•min)＝—————————×——————————
0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）

公式中：A — 为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。你按这个试一试，不行在交流