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许老板

金虫 (小有名气)

[交流] 胶原蛋白的提取，我综合的一个方案，麻烦大家看看，我有些疑问额。 已有6人参与

胶原蛋白的提取
实验原料：猪皮，氯仿，乙醇，乙酸，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，NaCl，NaOH，胃蛋白酶，蒸馏水。

实验器材：搅拌机，低温离心机，控温磁力搅拌器，电子天平，透析设备，PH试纸，烧杯，玻璃棒，小刀，研钵。

实验需配药品：A:氯仿/乙醇（2:1）约需400ml，
B:0.5mol/L乙酸约3000ml，
C:6mol/L NaOH溶液约40ml,
D:质量分数0.1％、0.01％的乙酸（透析用），
E:含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液约需200ml。

实验步骤：
1,猪皮的前处理：
（1）称取猪皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切；
（2）将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次；
（3）将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，E）充分洗涤（2h）以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。

2,提取胶原蛋白：
（1）进行前处理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），搅拌并维持在4℃，提取48h；
（2） 高速冷冻离心机离心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L（NaCl2.2mol）搅拌过夜；
（3）低温离心，将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐级用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml冰醋酸计），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反复盐析、酸溶。最后得到的上清液即为胶原粗提液。

3,胶原蛋白提纯:
（1）在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）调节pH值到7，冷冻离心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末，缓慢搅拌，4 ℃静置过夜保存；
（2）离心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，将溶解液装入透析袋中，用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸馏水透析3d，每天换透析液两次，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液；
（3）将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白样品，备用。
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1楼 2013-04-16 22:14:14
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fool_proof

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄酮: 金币+1, 谢谢回帖交流 2013-04-17 21:10:58
引用回帖:
6楼: Originally posted by 许老板 at 2013-04-17 15:29:10
根据你说的，这里具体的步骤是不是这样啊？加氯化钠至4.4mol/L，搅拌过夜，离心取沉淀，沉淀用乙酸溶，加氯化钠到2.4mol/L，搅拌过夜，离心取沉淀，沉淀再用乙酸溶，加氯化钠到1.7mol/L，搅拌过夜，离心取沉淀，沉 ...

我们的做法是：胶原提取物初步盐析后的沉淀，加入tris中性液中（tris=0.1M，NaCl=1.0M, pH=7.2~7.6），搅拌使沉淀溶解，再加NaCl至浓度为1.7M进行盐析。离心取上清，加入NaCl至最终浓度为2.6M。再次离心取沉淀溶于1%的乙酸中，4℃下静置过夜。
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渴望旅游
7楼2013-04-17 17:57:24
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红舟流星 at 2013-04-16 23:04:57
疑问在哪里？

这个方案怎么样啊？然后下面是关于这个方案的疑问。
1，在2（2）中加氯化钠是为了让胶原蛋白析出，离心后取出的是沉淀，后面逐级盐析氯化钠浓度降低是为什么啊？然后最后说取得是上清液，为什么之前是取沉淀这里又取清液啊？
2，在3（1）中加氢氧化钠是为了除酶吗？这里氢氧化钠浓度很高，能不能用浓度低一点的以免加过了啊？
3，还是在3（1）加氯化钠粉末的原因是什么啊？加多少比较合适啊？

谢谢谢谢！！！！
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3楼2013-04-16 23:10:59
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jhoo

至尊木虫 (知名作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄酮: 金币+1, 谢谢回帖交流 2013-04-17 09:40:27
红舟流星: 应助指数+1, 欢迎来生物材料板块应助交流 2013-04-17 11:45:07
加入氯化钠个人认为刚开始的浓度是盐析，后几步也是盐析，但最后加盐量少的时候是盐溶；另外加氢氧化钠是中和醋酸，必须加高浓度的是防止溶液体积过大，只能是少量多次滴加进行控制。氯化钠粉末的加入量个人觉得你只限于一片文献，无法推断，最好你多看几篇文献，在进行设计，或者进行预实验。
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4楼2013-04-17 05:36:53
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fool_proof

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
红舟流星: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎来生物材料板块应助交流 2013-04-17 14:15:34
再逐级用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml冰醋酸计），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反复盐析、酸溶，这一步和我们的做法相反，2.4mol/L是为了盐析I型胶原，1.7是为了沉淀III型胶原
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渴望旅游
5楼2013-04-17 12:58:43
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