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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 天然生物材料 » 胶原蛋白的提取，我综合的一个方案，麻烦大家看看，我有些疑问额。
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许老板

金虫 (小有名气)

[交流] 胶原蛋白的提取，我综合的一个方案，麻烦大家看看，我有些疑问额。 已有6人参与

胶原蛋白的提取
实验原料：猪皮，氯仿，乙醇，乙酸，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，NaCl，NaOH，胃蛋白酶，蒸馏水。

实验器材：搅拌机，低温离心机，控温磁力搅拌器，电子天平，透析设备，PH试纸，烧杯，玻璃棒，小刀，研钵。

实验需配药品：A:氯仿/乙醇（2:1）约需400ml，
B:0.5mol/L乙酸约3000ml，
C:6mol/L NaOH溶液约40ml,
D:质量分数0.1％、0.01％的乙酸（透析用），
E:含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液约需200ml。

实验步骤：
1,猪皮的前处理：
（1）称取猪皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切；
（2）将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次；
（3）将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，E）充分洗涤（2h）以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。

2,提取胶原蛋白：
（1）进行前处理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），搅拌并维持在4℃，提取48h；
（2） 高速冷冻离心机离心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L（NaCl2.2mol）搅拌过夜；
（3）低温离心，将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐级用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml冰醋酸计），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反复盐析、酸溶。最后得到的上清液即为胶原粗提液。

3,胶原蛋白提纯:
（1）在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）调节pH值到7，冷冻离心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末，缓慢搅拌，4 ℃静置过夜保存；
（2）离心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，将溶解液装入透析袋中，用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸馏水透析3d，每天换透析液两次，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液；
（3）将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白样品，备用。
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1楼 2013-04-16 22:14:14
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红舟流星 at 2013-04-16 23:04:57
疑问在哪里？

这个方案怎么样啊？然后下面是关于这个方案的疑问。
1，在2（2）中加氯化钠是为了让胶原蛋白析出，离心后取出的是沉淀，后面逐级盐析氯化钠浓度降低是为什么啊？然后最后说取得是上清液，为什么之前是取沉淀这里又取清液啊？
2，在3（1）中加氢氧化钠是为了除酶吗？这里氢氧化钠浓度很高，能不能用浓度低一点的以免加过了啊？
3，还是在3（1）加氯化钠粉末的原因是什么啊？加多少比较合适啊？

谢谢谢谢！！！！
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3楼2013-04-16 23:10:59
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fool_proof at 2013-04-17 12:58:43
再逐级用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml冰醋酸计），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反复盐析、酸溶，这一步和我们的做法相反，2.4mol/L是为了盐析I型胶原，1.7是为了沉淀III型胶原

根据你说的，这里具体的步骤是不是这样啊？加氯化钠至4.4mol/L，搅拌过夜，离心取沉淀，沉淀用乙酸溶，加氯化钠到2.4mol/L，搅拌过夜，离心取沉淀，沉淀再用乙酸溶，加氯化钠到1.7mol/L，搅拌过夜，离心取沉淀，沉淀再酸溶，加氯化钠到1.0mol/L，搅拌过夜，离心取沉淀，用乙酸溶然后这个溶液就是胶原粗提液？


然后，如果是用你的步骤，具体应该怎么做呢？麻烦一定具体一点，我刚刚开始在实验室做实验，很多事情都不知道，非常谢谢

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6楼2013-04-17 15:29:10
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fool_proof at 2013-04-17 17:57:24
我们的做法是：胶原提取物初步盐析后的沉淀，加入tris中性液中（tris=0.1M，NaCl=1.0M, pH=7.2~7.6），搅拌使沉淀溶解，再加NaCl至浓度为1.7M进行盐析。离心取上清，加入NaCl至最终浓度为2.6M。再次离心取沉淀溶于 ...

意思是4.4mol/L的氯化钠盐析后搅拌过夜离心取沉淀，然后就按你说的做，加氯化钠为1.7M以后需要静置还是搅拌，时间是多少啊？加到2.6M的静置？搅拌？一晚上？最后沉淀溶于1%的乙酸，4℃静置过夜，之后需要离心吗？如果需要离心应该是取上清吧！后面的步骤按我拟的那个来可以吧？还想问问这个方案怎么样啊！(我的问题好多)感谢感谢。

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8楼2013-04-17 18:32:24
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by fool_proof at 2013-04-17 19:22:19
我前后的回复一起看吧，具体的时间需要你自己摸索。你这方案在盐析纯化这一步，我觉得弄反了。还有一点，6 mol/L NaOH溶液（C）调节pH值到7，胶原也肯能沉淀出来。猪龄的大小对工艺影响很大，胎牛皮或者新生牛皮最 ...

你说的盐析纯化那一步反了，用你的方案就是对的吧！加NaOH到７我看其他文献有５，６的，我做一组对比看看吧，谢谢你。老师提供的就是猪皮了，原料没得选择。

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10楼2013-04-17 19:51:13
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by fool_proof at 2013-04-17 19:22:19
我前后的回复一起看吧，具体的时间需要你自己摸索。你这方案在盐析纯化这一步，我觉得弄反了。还有一点，6 mol/L NaOH溶液（C）调节pH值到7，胶原也肯能沉淀出来。猪龄的大小对工艺影响很大，胎牛皮或者新生牛皮最 ...

胶原蛋白透析，老师说要看透析需要的分子量来处理透析袋，我在网上查了下，方案里面都没有这方面的说明，求助求助啊！！
还有胃蛋白酶处理之后，加氯化钠至4.4mol/L，就像凝胶一样，这种状态对不对啊，下一步离心都不好处理了额。
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11楼2013-05-17 10:45:05
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by fool_proof at 2013-05-17 14:02:19
一般都是8000~14000的透析袋
凝胶状有点不正常，盐析一般都是有沉淀的，剩下的是水溶液。...

粉末状的沉淀吗？前一步提取之后离心的上清就是比较稠的溶液，我是直接加的nacl固体，然后就像胶一样了。

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13楼2013-05-17 18:43:18
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by fool_proof at 2013-05-17 14:02:19
一般都是8000~14000的透析袋
凝胶状有点不正常，盐析一般都是有沉淀的，剩下的是水溶液。...

加NaCl到4.4M以后就成了烧杯里面那样，离心我用了4℃ 8000r/min 15min 一次没效果，两次就是离心管的那样了。是不是因为猪皮前期处理脂肪没除干净啊？在用胃蛋白酶提取时也是浑浊的稠液。

IMAG0943.jpg



IMAG0944.jpg



IMAG0945.jpg
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14楼2013-05-17 23:50:35
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by fool_proof at 2013-05-17 14:02:19
一般都是8000~14000的透析袋
凝胶状有点不正常，盐析一般都是有沉淀的，剩下的是水溶液。...

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15楼2013-05-18 23:24:48
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许老板

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by fool_proof at 2013-05-19 20:20:13
转速提高下试试，看离心管的情况是离心力不够...

老师也是这样说的  我加到了12000   勉强弄出来了，，，现在又有新问题了，，
我是照你的方案来的：加入tris中性液中（tris=0.1M，NaCl=1.0M, pH=7.2~7.6），搅拌使沉淀溶解，再加NaCl至浓度为1.7M进行盐析。离心取上清，加入NaCl至最终浓度为2.6M。再次离心取沉淀溶于1%的乙酸中，4℃下静置过夜。  tris中性液ph=7.40   沉淀溶解不明显，，，，然后我想了下  溶多少算多少吧，，，然后就离心取上清了，，，，现在加NaCl，，，没有沉淀出来
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17楼2013-05-19 23:22:13
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