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hgj19880701

银虫 (初入文坛)

[求助] 5 RACE巢式扩增产物跑胶图分析

Marker的左边为5 RACE跑胶图,自左至右分别是 gsp2、双引物、AUAP、marker。
目的片段大概有500bp多一些(外层扩增的大概有600bp多一些)。反应程序没用tochdown,退火温度60度。我想知道
1、我的5 RACE模板反转纯化加尾产物是否有问题。
2、2个单引物都出现了条带,正常否?(单引物条带处对应的双引物处没有条带)
3、双引物处条带有2个,怎么解释?
4、我该采取什么措施改善这种结果?升高退火温度?减少模板量?
5、这种图能不能继续做下去切胶回收。

照胶.jpg
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hgj19880701

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shangrila911 at 2013-04-14 09:21:44
回收试试吧 ,比我的强多了 ,我5'RACE都做了半年了  PCR扩增都没出现过目的带!全是引物二聚体;   
顺便请教一下,在反转录之前,处理RNA时哪一步最关键 ,总感觉RNA处理过程中就降解了!

我们采用trizol一步法提取,也许有很多点注意点,其中2点就是:
1、上清吸取,不要任何杂质。
2、摇晃振动要到位。
3、加DEPC水的量取决于沉淀的多少。不是还要测OD吗?保证在适当范围(1.8--2.0),
3楼2013-04-18 09:14:57
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shangrila911

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
回收试试吧 ,比我的强多了 ,我5'RACE都做了半年了  PCR扩增都没出现过目的带!全是引物二聚体;   
顺便请教一下,在反转录之前,处理RNA时哪一步最关键 ,总感觉RNA处理过程中就降解了!
一切都会好的!
2楼2013-04-14 09:21:44
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