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hgj19880701

银虫 (初入文坛)

[求助] 5 RACE巢式扩增产物跑胶图分析

Marker的左边为5 RACE跑胶图，自左至右分别是 gsp2、双引物、AUAP、marker。
目的片段大概有500bp多一些（外层扩增的大概有600bp多一些）。反应程序没用tochdown，退火温度60度。我想知道
1、我的5 RACE模板反转纯化加尾产物是否有问题。
2、2个单引物都出现了条带，正常否？（单引物条带处对应的双引物处没有条带）
3、双引物处条带有2个，怎么解释？
4、我该采取什么措施改善这种结果？升高退火温度？减少模板量？
5、这种图能不能继续做下去切胶回收。

照胶.jpg
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1楼 2013-04-12 09:43:06
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shangrila911

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收试试吧 ，比我的强多了 ，我5'RACE都做了半年了  PCR扩增都没出现过目的带！全是引物二聚体；   
顺便请教一下，在反转录之前，处理RNA时哪一步最关键 ，总感觉RNA处理过程中就降解了！
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一切都会好的!
2楼2013-04-14 09:21:44
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hgj19880701

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shangrila911 at 2013-04-14 09:21:44
回收试试吧 ，比我的强多了 ，我5'RACE都做了半年了  PCR扩增都没出现过目的带！全是引物二聚体；   
顺便请教一下，在反转录之前，处理RNA时哪一步最关键 ，总感觉RNA处理过程中就降解了！

我们采用trizol一步法提取，也许有很多点注意点，其中2点就是：
1、上清吸取，不要任何杂质。
2、摇晃振动要到位。
3、加DEPC水的量取决于沉淀的多少。不是还要测OD吗？保证在适当范围（1.8--2.0），
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3楼2013-04-18 09:14:57
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