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7782663

铜虫 (正式写手)

[求助] 细胞周期问题

看了很多关于细胞周期的做法 我想请教各位
1、细胞消化要理想,资料显示最好消化时加EDTA,可使流式做的很漂亮;
2、细胞消化后不可吹打过度,减少细胞破碎;以后的吹打也要注意,尤其是固定后的细胞容易破碎;
3、 细胞用PBS洗涤离心,转速不超过1000r/min,有文献用800r/min;可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞(有人主张用钢网,以 减少细胞与尼龙网粘连的损失,本人认为钢网易损伤细胞,DNA外溢也会造成细胞粘连,所以在细胞数足够的情况下,首选尼龙网);
4、离心后的固定,标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精,而不是向细胞中加酒精,这样是为了减少细胞聚集,这一点很重要,很多人都忽视了!

第四步骤中的 细胞悬液用什么吹打成悬液的呢?? 70%酒精还是啥呢????
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7782663

铜虫 (正式写手)

我用的是肿瘤细胞 每次都需要用移液枪吹打成单个细胞 因为有很多都会聚集在一起的  我用的就是HepG2
5楼2013-04-08 08:33:31
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ququ1105

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-04-02 19:40:20
7782663: 金币+1 2013-04-04 14:15:18
楼主不用担心,细胞周期是非常简单的实验,只要你的细胞正常,流式细胞仪也正常,基本上怎么做都能出结果的。70%乙醇是用来固定细胞的,让细胞停止在你固定的那个时候的周期。吹打成悬液的方法是,你离心倒掉上清再把管子正过来时底下肯定有剩余的PBS,用手磕匀就行了,就和你传细胞时离心管里细胞敲匀是一样的。
2楼2013-04-02 16:29:39
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7782663

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ququ1105 at 2013-04-02 16:29:39
楼主不用担心,细胞周期是非常简单的实验,只要你的细胞正常,流式细胞仪也正常,基本上怎么做都能出结果的。70%乙醇是用来固定细胞的,让细胞停止在你固定的那个时候的周期。吹打成悬液的方法是,你离心倒掉上清再 ...

磕匀是指细胞成单个细胞吗,还是指大概细胞不成团块
3楼2013-04-04 14:14:59
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ququ1105

银虫 (小有名气)

是否是单个细胞要看你消化的程度啦,如果消化不到时间或者消化过了的话细胞就会抱团,使劲用移液枪吹或者使劲磕只能把细胞吹得状态更差。至于成团块,我不知道楼主用的什么细胞啦,一般的细胞都不会抱团的,也没必要用滤网过就可以做出很漂亮的周期图。我印象中我实验室里只有hepG2.2.15貌似会抱团,做周期时要用滤网过滤一下,用的也是最普通的那种,分小鼠肝脾淋巴细胞用的250目铜网。
4楼2013-04-04 19:08:31
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